导 读

丙烯醛是一种高活性的α，β-不饱和醛。它是一种众所周知的呼吸刺激物，存在于烟草烟雾和燃烧产物中。人类通过吸烟接触丙烯醛可以发生在极高的水平。因此，已经发现吸烟者唾液中丙烯醛的浓度在5至38 μM之间，而在吸烟后立即呼吸道衬里液中的浓度高达80 μM。暴露于丙烯醛被认为是与吸烟有关的心血管疾病以及呼吸系统疾病，包括慢性阻塞性肺病和肺癌的主要危险因素。

虽然丙烯醛的吸入剂量测定已经在动物，特别是啮齿动物中进行了广泛的研究，但最近从计算流体力学(CFD)/基于生理学的药代动力学(PBPK)模型的发现揭示了与人类和啮齿动物之间的解剖学和生理学以及呼吸方式的差异有关的物种特异性组织暴露位点。鉴于游离丙烯醛在细胞中的定量挑战，相对稳定的丙烯醛衍生物，包括gsh丙烯醛加合物和羰基化蛋白，在这项研究中进行了评估。探索了这些参数作为丙烯醛剂量测定的替代物的潜力。

目 的

建立准确的剂量测定方法对于评价外来药物的毒性以及比较不同测试系统的反应。本研究以丙烯醛为模型毒物，建立了正常人支气管上皮(NHBE)细胞和人粘液表皮样肺癌(NCI-H292)细胞关键不良反应的浓度-反应关系。我们开发了一种间接估计丙烯醛细胞内摄取的新方法。本研究中提出的剂量学分析可能为使用不同测试系统的丙烯醛的计算建模和风险评估提供有用的信息。

材料和方法

1、化学品和试剂

2、细胞培养

3、丙烯醛的处理

4、细胞活力测定

5、使用GC-MS/MS定量丙烯醛浓度

6、丙烯醛摄取的估计

7、蛋白质羰基ELISA

8、通过LC-MS定量GSH和GSSG

9、谷胱甘肽-丙烯醛加合物的合成

10、UFLC-MS/MS法测定谷胱甘肽-丙烯醛结合物的含量

11、统计分析

所有实验重复三次，数据表示为平均值±标准差(s.d。)。使用GraphPadPrism7.04(LaJolla，CA)确定统计学显着性。方法方差分析(ANOVA)，然后使用Dunnett的多重比较。

丙烯醛的摄取与其细胞毒性高度相关。NHBE和NCI-H292细胞中给药(a)和丙烯醛摄取浓度(b)的浓度-生长抑制反应曲线。细胞用12.5至100μM丙烯醛处理10分钟，用DPBS洗涤，并在培养基中回收24小时。NHBE细胞中丙烯醛摄取量高于100μM的NCI-H292细胞。结果(n=8)表示为平均值±s.d.*p<0.05，与治疗组比较有统计学意义(p<0.05)。

结 果

1、NHBE细胞较高的细胞毒性与丙烯醛的细胞摄取量增加有关

2、在整个10分钟的处理持续时间内，NHBE细胞中的丙烯醛摄取更大

3、蛋白质氧化在NCI-H292细胞中更容易发生

4、GSH-ACR加合物的形成与丙烯醛的摄取呈正相关

NHBE和NCI-H292细胞中丙烯醛的摄取效率。细胞用50μM丙烯醛处理30秒至10分钟。在指定的时间点(a)实验测定丙烯醛的摄取浓度(μg/cm2)，并用线性回归模型(b)拟合摄取率的倒数(1/(μg/min/cm2)。请注意，NHBE细胞中的丙烯醛摄取效率高于NCI-H292细胞。结果(n=3)表示为平均值±s.d.#，*p<0.05，与治疗组比较有统计学意义(p<0.05)。

NHBE和NCI-H292细胞中蛋白质羰基化的诱导。绘制蛋白质羰基化水平与给药(a)和丙烯醛摄取浓度的关系(b)在NHBE和NCI-H292细胞中。在这两种细胞类型中，蛋白质羰基形成的动力学表现为处理持续时间(c)和每个时间点(d)的摄取浓度(d)的函数。请注意，蛋白质羰基化以时间依赖性方式诱导，但与在各个时间点测量的丙烯醛的摄取没有线性相关性。结果(n=3)表示为平均值±sd。*p<0.05被认为是统计学显著性相比，各自的dpbs治疗对照。

NHBE和NCI-H292细胞中GSH的消耗。绘制NHBE和NCI-H292细胞中GSH的细胞内水平与给药(a)和丙烯醛(b)的摄取浓度。请注意，当绘制与摄取浓度相比时，浓度-反应曲线的线性改善。在这两种细胞类型中，GSH消耗的动力学表示为处理持续时间(c)和每个时间点(d)的摄取浓度的函数。请注意，在NHBE细胞中GSH消耗发生得更快，并且与在各个时间点测量的丙烯醛的摄取呈线性相关。结果(n=3)表示为平均值±s.d.#，*p<0.05，与治疗组比较有统计学意义(p<0.05)。

在NHBE和NCI-H292细胞中形成GSH-ACR加合物。绘制GSH-ACR加合物的细胞内水平与NHBE和H292细胞中丙烯醛(b)的施用(a)和摄取浓度。请注意，当绘制相对于摄取浓度时，NCI-H292细胞中浓度-反应曲线的线性改善。在这两种细胞类型中，GSH-ACR加合物形成的动力学表现为处理持续时间(c)和每个时间点(d)的摄取浓度(d)的函数。请注意，在NHBE细胞中通常观察到高水平的GSH-ACR加合物的形成。结果(n=3)表示为平均值±s.d.#，*p<0.05被认为是统计学上显著的相比，各自的dpbs治疗的对照。

讨 论

由于丙烯醛的不稳定性和高反应性，确定细胞摄取仍然是一个主要的挑战。在本研究中，我们发展了一种新的方法来估计摄取丙烯醛与修正蒸发和吸附聚苯乙烯塑料在两个广泛使用的体外肺细胞模型，即正常原代NHBE细胞和癌NCI-H292细胞。这是首次定义和比较两种细胞类型丙烯醛的细胞摄取与其暴露引起的关键不良分子事件之间的关系。本研究中产生的数据表明，10分钟治疗后丙烯醛的摄取迅速减少。这些信息对于解释丙烯醛的体外吸入毒性数据很重要，并将提供更好的理解丙烯醛的毒性作用模式。这两种细胞类型在摄取浓度和速率方面表现出差异，NHBE细胞在摄取丙烯醛方面更有效。

GSH-ACR加合物的定量分析为丙烯醛代谢物在这两种体外肺模型中的形成提供了确凿的证据。我们可以准确地测定NHBE和NCI-H292细胞中GSH-ACR加合物的含量，并观察到丙烯醛的摄取浓度与GSH-ACR加合物形成之间有很强的线性相关性，这些数据表明，细胞内GSH-ACR加合物的浓度可能更好地反映体外丙烯醛暴露比其他参数。

传统上认为，外来生物素与谷胱甘肽的结合是一种解毒反应，但现在的证据也表明它在毒性代谢物的形成中的作用。GSH加合物的过度产生可能通过ROS产生和氧化应激诱导细胞毒性。我们推测NCI-H292细胞对丙烯醛毒性的抵抗可能是由于较高水平的代谢酶，如醛酮还原酶(AKR)1B1和AKR1B10，可能有助于更有效地丙烯醛的解毒。

总之，我们定义并比较了未转化的未分化的NHBE细胞和转化的癌细胞NCI-H292之间丙烯醛毒性的关键浓度-反应关系。开发了间接估计细胞内丙烯醛浓度的新方法。此外，在这两种细胞模型中系统地研究了丙烯醛细胞摄取与两种主要丙烯醛结合产物，即蛋白羰基和GSH-ACR加合物形成之间的早期时间关系。发现NHBE细胞对丙烯醛暴露更敏感。总体发现的分析表明，对丙烯醛暴露的细胞易感性与丙烯醛摄取和GSH-ACR加合物的形成密切相关。