导 语

        肿瘤组织和血液是目前晚期非小细胞肺癌(aNSCLC)分子检测的主要取材方式[1]，而与组织及血液相比，替代性液体活检具有侵入性更小及更容易获得的特性，例如痰和尿液，甚至在某些患者群体检测基因变异的表现优于血液。目前为止，已经有证据表明用可能含有肿瘤细胞的液体进行基因分型是可行的，例如胸腔积液、脑脊液、尿液和痰液等[2-4]。已发表的研究侧重于痰液替代血液进行突变分析，然而这些研究大多侧重于利用基于PCR的方法检测EGFR敏感突变和T790M突变，而鲜有使用较大Panel进行NGS检测以得到基因突变谱[5-7]。既往的研究证明了血液和痰液在驱动变异检测性能的可比性，并且建议临床应用场景中可以考虑使用痰液[8]。

        然而，还有尚未解决的问题，比如具有哪些临床特征的患者可以得到一致性更高的检测结果;如何使用这些临床特征指导选择哪种液体活检方式进行整体突变谱检测，而不仅仅局限于检测驱动基因变异;使用痰液以评估肺癌肿瘤突变负荷(TMB)是否可行。因此，对aNSCLC患者痰液用于基因组分析的临床应用仍需要进行更深入的探索。

        广州医科大学附属第一医院周承志教授团队开展了一项前瞻性研究，旨在探索痰液上清作为晚期非小细胞肺癌液体活检取材方式的可行性。研究利用燃石OncoScreen Plus® 520基因panel(组织版，血液版)，通过比较配对肿瘤组织，痰液及血液样本的突变检出率、突变谱一致性、驱动基因突变一致性等方面表现，结合临床组织学特征分析，为选择痰液作为液体活检标本的临床应用场景提供参考。该研究结果发表在Respiratory Research(IF=7.16)

        研究内容

        这项前瞻性研究纳入了71例在2019年9月-2020年9月广州医科大学附属第一医院未经治疗的III-IV期非小细胞肺癌患者，把配对的肿瘤组织(TIS)，痰液(SPU)，血液(PLA)进行基因突变谱分析，并比较突变检测表现。

        研究结果

        TIS、SPU和PLA样本用于突变谱分析的关键质量控制指标

        入组的71例患者均取了配对的TIS、SPU和PLA完成NGS检测。SPU的DNA含量(中位2185ng)最高，其次为TIS(中位560ng)，而PLA的DNA含量(中位50.5ng)显著较低。SPU的中位最大等位基因频率(maxAFs)为0.76%，PLA为1.34%(p=0.34)，两者均显著低于TIS 35.2%(p<0.001)(图1A)。插入片段的分布大小呈现相似的结果，SPU插入片段中位数为162bp，比PLA稍短但具有统计学差异(中位数168bp，p<0.001)，两者均显著短于TIS(中位数224bp，p<0.001;图1B)。

        总的来说，这些结果表明：与血液相比，痰液上清DNA含量更高，而maxAFs及插入片段与血液相似。

        图1. 肿瘤(TIS)、痰上清液(SPU)和血浆(PLA)的活检样本关键质量控制指标

        痰液上清的TMB、总检出率以及与临床组织学特征

        两种液体活检样本(SPU,PLA)均显示与肿瘤组织样本及相互间TMB水平高度相关，Pearson相关系数为SPU-TIS:0.92，PLA-TIS:0.94;SPU-PLA:0.95。总检出率定义为71位患者中同类样本中检测到任何体细胞突变的样本占比。如图3A所示，TIS的总检出率(95.8%)显著高于PLA(70.4%)及SPU(67.6%)，而PLA与SPU则较为相似(p=0.86)。而合并来自SPU与PLA的突变谱后总检出率进一步提高到85.7%(60/71)，故建议在经济条件允许的情况下可以采取双液体活检。

        图2.不同取材方式最常检测到的突变图谱，A肿瘤组织(TIS)、B痰液上清(SPU)和C血浆(PLA)

        分析SPU检测结果与14个临床组织学特征的相关性，发现检出率似乎不随样品采集方法而变化—自发痰样本(61.5%，8/13)和诱导痰样本(69.0%，40/58)的检出率相似(p=0.74)。值得注意的是，按照肺部肿瘤位置或组织学亚型进行分层，得到的检出率显著不同，包括：中央型肿瘤对比周围型肿瘤(79.5% vs. 53.6%，p=0.03;图3B);LUSC对比LUAD(93.3%对60.7%，p=0.03;图3C);而吸烟者的检出率也有高于非吸烟者的趋势(78.8% vs.57.9%，p=0.08;图3D)。有趣的是，患有胸膜炎患者相对比没有胸膜炎的患者检出率较低(52.6% vs.77.1%，，p=0.08)。

        比较SPU和PLA在不同患者群体中的突变检测表现，在39例中央型肿瘤患者中，TIS检出率为 94.9%，SPU检出率为 79.5%，PLA检出率为61.5%(图3E)。值得注意的是，在中央型亚组中SPU的表现优于PLA。相反，外周型肿瘤SPU检出率显著低于中央型肿瘤(53.6% vs.79.5%，p=0.03)，而其PLA检出率亦显著低于中央型肿瘤(53.6% vs.85.7%，p=0.02);(图3F)。 对比33名吸烟者TIS,SPU,PLA检出率，发现均有所提高，且SPU(78.8%)高于PLA(72.7%)(图3G)。相似地，在LUSC患者中，SPU检出率(93.3%)亦高于PLA(86.7%)(图3H)。

        以TIS作为参考，比较SPU及PLS突变谱一致性，其定义为：在整体队列或者亚组里配对标本没有检出变异或者检出至少一个共有突变，SPU vs. PLA整体队列突变谱一致性为67.6% , 48/71 vs.73.2%, 52/71, p=0.58。在LUSC亚组(93.3%, 14/15)，中央型肿瘤(76.9%, 30/39)，有吸烟史患者(75.8%, 25/33;)的SPU一致性有所提升。

        以上结果表明痰液上清在检测到的突变数量，突变阳性样本比例及TIS突变谱一致性这三个关键点上与血液具有可比性。此外在某些亚组中，比如中央型肺癌亚组、LUSC亚组痰液上清更有可能检测到基因组异常。

        整体患者及特定患者痰液上清检出NSCLC驱动突变基因的表现

        研究还分析了NSCLC特征性驱动基因突变的检出，包括EGFR、KRAS、ALK、ROS1，BRAF、MET、RET和NTRK1/2/3。以TIS为参考标准，比较了SPU和PLA的灵敏度、阳性预测值(PPV)和特异性。结果显示SPU驱动基因灵敏度(50.0%)较PLA(63.5%)低，但SPU及PLA均展现优秀的特异性和PPV。对于液体活检而言，根据临床组织学进行的分层分析显示某些亚组检出率有所提高。在有中枢神经系统疾病的NSCLC患者中，SPU的敏感性提高至63.0%。对于吸烟者，SPU和PLA呈现与TIS样本高度相似性，三个性能指标的水平相同：灵敏度68.8%，PPV1 00%，特异性100%(表1，图4)。SPU、PLA在总体队列的敏感性为50.0%，而在LUSC患者中上升到100%(表1)。

        聚焦每个突变的基因，研究发现SPU样本检测EGFR突变的灵敏度与PLA相比显著较低—总体队列SPU vs PLA为25.0% vs70.8%, 中央型肿瘤亚组25.0% vs.75.0%,吸烟史亚组33.3% vs.66.7%。相反，与PLA相比，ALK重排及KRAS热点突变更有可能从SPU中检测到 — 总体队列SPU vs PLA ALK:75.0% vs.37.5%，KRAS:83.3% vs.75.0%;中央型亚组ALK:71.4% vs.28.6%;KRAS:85.7% vs.57.1%(表1)。总而言之，当检测与TIS匹配的驱动基因突变时， SPU和PLA均显示出高特异性(范围97.1-100%)和高PPV(范围为87.5-100%)。

        综上，尽管整体队列中的SPU灵敏度较低，SPU在特定亚组中显示与PLA类似的灵敏度，包括有中央型肺癌、有吸烟史或LUSC的患者。此外，痰液上清可能可以更灵敏地检测某些驱动因素，如ALK重排和KRAS热点突变。

        图4.匹配的SPU-TIS和PLA-TIS标本比较NSCLC相关驱动基因突变概览

        表1 NSCLC经典驱动因子突变检测的关键性能指标

        选择液体活检用于突变谱分析的列线图

        研究进一步使用logistic回归构建列线图用于评估在什么场景下使用SPU可以比PLA更敏感地检测基因变异。使用多元逐步回归(stepAIC)，在EGFR和ALK突变状态已知(图5A-C)或未知的(图5D-F)的临床场景下推算出2个AUCs优越的模型。组织学亚型是SPU优势概率的决定性因素，具体而言，LUSC是唯一与SPU具有更高灵敏度的更大优势比(OR)相关的重要的特征(图5A、D)。气管侵犯显示与SUP优势正相关的趋势。另外，尽管相应的ORs均显示出较宽的置信区间，吸烟史和中央型肿瘤的患者亚组亦支持选择SPU作为检测样本。

        列线图预测SPU比PLA实现更敏感的NGS的可能性，不论EGFR和ALK突变状态未知或已知。

        图4.概率列线图预测痰液上清比血浆检测到更敏感基因组图谱的可能性，基于EGFR或ALK突变状态 (A–C未知或D–F已知)临床组织学特征

        研究小结

        该研究评估了利用痰液上清进行晚期NSCLC患者液体活检的可行性，研究结果提示痰液可做为潜在的替代性液体活检方案。

        痰液除了在关键质量控制指标、突变数量，与肿瘤组织突变谱一致性关键点上与血液具有可比性，在某些特定亚组，比如中央型肺癌亚组、LUSC亚组，痰液上清更有可能检测到基因组异常。痰液上清可以更灵敏地检测某些驱动因素，如ALK重排和KRAS热点突变。另外研究首次推算出根据临床组织学特征选择液体活检的列线图模型探索SPU在临床的具体应用场景，未来还需要更多的研究来研究痰液在晚期非小细胞肺癌基因组分析中的临床应用。

        参考文献

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