慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺，COPD)居世界死亡原因第3位，其特征是不可逆的肺功能下降，由气道炎症、肺气肿和肺泡损坏导致1,2。慢阻肺具有异质性，中性粒细胞炎症和嗜酸性细胞炎症是慢阻肺的两种主要炎症内型3-5。众多证据表明，气道微生物组与慢阻肺表型和内型相关，气道微生态失衡可能导致气道炎症的发生6,7。然而，迄今对气道微生物组功能特性、代谢活动和与宿主免疫系统的互作缺乏了解，对气道微生物组参与疾病发生发展的机制认知甚少。本团队前期通过多组学荟萃分析预测了气道微生物组与宿主相互作用影响慢阻肺发生发展的可能方式(Wang et al. ISME J, 2020)8。

        本研究进一步围绕“微生物-代谢-宿主”轴，对来自广东省两个临床中心的慢阻肺患者和健康人群的进行了深入的多组学研究。通过序贯中介效应分析，整合多组学数据，评估微生物组与慢阻肺主要炎症内型(中性粒细胞或嗜酸性细胞炎症)的联系。研究提出了一种识别与炎症表型相关慢阻肺“微生物-代谢-宿主”互作的分析策略，并通过体内外功能实验验证假设，阐明了气道微生物组在慢阻肺中的作用。

        该研究新近发表于国际权威的Nature子刊《Nature Microbiology》，王璋教授(华南师范大学)、陈荣昌教授(深圳市人民医院、广州医科大学)、周宏伟教授(南方医科大学)为共同通讯作者，领导各课题组共同合作完成。此外，该研究与领域内知名专家展开了合作，如澳大利亚新南威尔士大学Emad El-Omar教授、美国加州大学Jack Gilbert教授，美国罗格斯大学Martin Blaser教授，加拿大麦克马斯特大学Martin Stampfli教授(曾为广州医科大学特聘教授)等参与本研究并对数据分析、论文撰写与修改提供指导。既往慢阻肺呼吸道微生物组多为描述性研究，机制不明确，本研究首次系统阐明慢阻肺呼吸道菌群宿主调控机制，为应用菌群作为慢阻肺诊断与干预靶标奠定基础。

        - 主要研究结果 -

        01 从临床队列多组学联合分析提出“微生物-代谢物-宿主”互作假说

        图 1. 多组学研究流程图

        假设气道菌群产生或消耗代谢分子，其对宿主基因表达的影响在中性粒细胞和嗜酸性慢阻肺中存在差异。为了验证这一假设，沿着“菌群-代谢-宿主”轴的多组学模块进行了序贯中介效应分析，以评估微生物组(MetaG)依次通过代谢组(MetaB)、宿主转录组(HostT)、和蛋白质组(HostP)对宿主表型(中性粒细胞和嗜酸性粒细胞炎症)的影响。发现相对于嗜酸性型慢阻肺，中性粒型慢阻肺具有更强的“微生物-宿主”关联效应。

        分别确定与中性粒型与嗜酸型慢阻肺相关的“微生物组-代谢组-宿主转录组、蛋白组”互作链条。中性粒细胞炎症中发现了一条与色氨酸代谢相关的互作链条具有较高预测功效。其中，代谢组MetaB-M056模块中吲哚-3-乙酸(IAA)代谢物与宏基因组中色氨酸分解代谢途径(P00380)关联，基于IAA与Cyclin D1相互作用的证据，该MetaB模块又与富集至白细胞介素-22(IL-22)信号通路的宿主转录组模块HostT-M318相关联(图3)。由此提出假说，即慢阻肺气道菌群中色氨酸代谢途径的改变可能导致IAA降低，进而导致对中性粒细胞炎症和上皮细胞凋亡的保护作用丧失。

        对MGS进行物种留一法分析，确定了每种宏基因组模块及其中KO的关键驱动物种。发现唾液乳杆菌和188体育平台论坛 乳杆菌可贡献IAA合成基因K01426的丰度变化。

        图2. 慢阻肺不同炎症内型相关“菌群-代谢物-宿主”互作关联图谱

        02 体内外实验验证气道微生物来源IAA改善肺功能下降、炎症反应和组织细胞凋亡

        图3 气道微生物与宿主互作机制图

        首先明确IAA来源于气道而非肠道菌群(图4a)。在肺气肿模型小鼠中，腹腔内注射IAA可减轻肺功能下降、肺气肿、组织损伤、胶原增殖收缩以及TNF-alpha、IL-1beta、IL-6和IL-17A的水平(图4b、c)。IAA提高了小鼠肺中IL-22和Cyclin D1的水平(图4)，验证了人群发现。同时在经典慢阻肺熏烟模型小鼠中进一步验证了以上结果。

        IAA减轻肺组织凋亡，改变了凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表达(图4e-g)。在用芳香烃受体(AhR)抑制剂处理的小鼠中，IAA诱导的肺功能恢复和IL-22合成的作用被消除(图4h)，这表明IAA的作用依赖于AhR。IL-22的中和作用逆转了IAA对细胞凋亡的影响，但对炎症介质的表达没有显著影响(图4i)。在慢阻肺模型中，IAA导致肺泡和肺间质巨噬细胞产生的IL-22比其他细胞来源(ILC-3、CD4+ T细胞、NKT细胞)增幅更大(图4j)。

        细胞水平上，使用香烟烟雾提取物(CSE)体外处理小鼠巨噬细胞RAW264.7可降低IL-22的产生，而IAA恢复了CSE刺激的巨噬细胞的IL-22水平。上述结果在小鼠原发性肺泡巨噬细胞中也得到了验证。IL-22处理CSE刺激的小鼠肺上皮细胞系MLE12，可以减轻细胞凋亡，促进上皮重塑。Bax/Bcl-2比值的改变和cleaved caspase-3表达也重现了小鼠实验的结果。在RAW264.7-MLE12共培养系统中，IAA处理RAW264.7可显著减少MLE12细胞的凋亡，这种作用可通过中和IL-22逆转，表明IL-22可能介导肺“巨噬-上皮”互作来缓解上皮凋亡。

        进一步探讨了唾液乳杆菌(L. salivarius)和188体育平台论坛 乳杆菌(L. oris)这两种乳杆菌作为气道IAA潜在产生菌的作用。接种两种乳酸菌可同时减缓肺功能下降、组织损伤和细胞凋亡，并降低了气道IL-1beta、IL-6和IL-17A的水平(图4k)。

        图4. IAA可改善肺功能下降、中性粒细胞炎症和细胞凋亡

        - 总结和讨论-

        本研究通过微生物组与宿主多组学分析，绘制了气道“微生物-代谢-宿主”相互作用的全景图谱。与嗜酸性慢阻肺相比，中性粒型慢阻肺有更显著的气道“微生物-宿主”关联。通过沿“微生物组-代谢物-宿主”轴的序贯中介效应分析评估多组学关联，并利用微生物遗传信息和代谢物-靶标配对信息，确定“微生物-宿主”互作的机制假说。数据揭示的一个潜在关键假说是气道微生物组产生IAA可能缓解慢阻肺中性粒细胞性炎症和上皮细胞凋亡。通过体内外实验，发现IAA可通过肺巨噬细胞中产生IL-22来减轻组织凋亡，从而缓解肺气肿和肺功能下降，但不能排除其他IL-22主要来源细胞(如CD4 T、ILC3、NKT细胞)对该通路的贡献。确定了两株乳杆菌作为潜在的气道IAA产生菌，具有气道炎症与组织凋亡的保护功效，但同时发现气道病原菌如铜绿假单胞菌也可产生IAA，进一步提示复杂的气道菌群宿主互作效应。本研究的局限性包括相对较少的研究人群、痰液对下呼吸道的不完全表征、小鼠模型不能完全模拟慢阻肺人群表型、以及缺乏对嗜酸性慢阻肺的机制证据等。尽管如此，本研究结果表明气道微生物组可通过代谢活动调控慢阻肺关键病理生理特征，为靶向微生物-宿主互作的慢阻肺潜在新型治疗策略提供了机制基础。

        本研究得到了国家重点领域研发计划(2017YFC1310600)、国家自然科学基金(31970112、32170109)、广东省自然科学基金(2019A1515011395)、深圳市科创委项目(KCXFZ202002011008256)、以及广东省医学科研基金项目(C2019001)的支持。

        参考文献

        1. World Health Organization. Chronic obstructive pulmonary disease (COPD). http://www.who.int/respiratory/copd/en/ (accessed 2021).

        2. GOLD. 2022 Global Strategy For Prevention, Diagnosis And Management Of COPD. 2022. https://goldcopd.org/2022-gold-reports-2/ (accessed Feb 13 2022).

        3. Garudadri S, Woodruff PG. Targeting Chronic Obstructive Pulmonary Disease Phenotypes, Endotypes, and Biomarkers. Ann Am Thorac Soc 2018; 15(Suppl 4): S234-S8.

        4. Roca J, Vargas C, Cano I, et al. Chronic Obstructive Pulmonary Disease heterogeneity: challenges for health risk assessment, stratification and management. J Transl Med 2014; 12 Suppl 2: S3.

        5. Barnes PJ. Inflammatory endotypes in COPD. Allergy 2019; 74(7): 1249-56.

        6. Mayhew D, Devos N, Lambert C, et al. Longitudinal profiling of the lung microbiome in the AERIS study demonstrates repeatability of bacterial and eosinophilic COPD exacerbations. Thorax 2018; 73(5): 422-30.

        7. Wang Z, Locantore N, Haldar K, et al. Inflammatory Endotype-associated Airway Microbiome in Chronic Obstructive Pulmonary Disease Clinical Stability and Exacerbations: A Multicohort Longitudinal Analysis. Am J Respir Crit Care Med 2021; 203(12): 1488-502.

        8. Wang Z, Yang Y, Yan Z, et al. Multi-omic meta-analysis identifies functional signatures of airway microbiome in chronic obstructive pulmonary disease. ISME J 2020; 14(11): 2748-65.