2022年4月2日，同济大学附属上海市肺科医院姜格宁/徐建芳/郑迪教授团队和思路迪转化医学研究团队合作的科研成果，在医学、生命科学与纳米科学领域知名杂志《Journal of Nanobiotechnology》(IF=10.435)上发表。

        该研究首次揭示了不确定性肺结节(indeterminate pulmonary nodules, IPNs)患者血浆外泌体来源的miRNA特征，发现并验证了基于血浆外泌体miRNA模型CirsEV-miR可用于预测IPNs的良恶性，助力肺癌早诊。此外，该研究还首次报道了患者的血浆外泌体miRNA表达谱随肿瘤恶性程度增加(良性结节、原位腺癌/微浸润腺癌、浸润性腺癌)而逐渐变化。

        研究背景

        肺癌是世界上最常见、发病率和病死率均最高的恶性肿瘤。随着低剂量螺旋CT(LDCT)的普及，肺结节的检出率有了明显提升。然而，许多肺结节仅通过LDCT难以判断良恶性，被称为不确定性肺结节(indeterminate pulmonary nodules, IPNs)。

        虽然LDCT敏感性极高，但特异性较差，这导致许多实际为良性肺结节进行了不必要的手术切除，给患者带来额外的风险与开支。因此，通过非侵入性检测区分IPNs良恶性，对肺结节的临床诊断及后续治疗都非常重要。

        外泌体(Exosomes)是由多种细胞分泌至胞外的一种小型胞外囊泡，直径约30~150 nm，包含核酸、蛋白质、脂质等活性物质，具有介导细胞间信息传递的功能，并且携带来自于供体细胞的特征，目前已成为液体活检领域的热点。

        肺癌患者血浆外泌体中所包含的miRNA与健康人群有很大不同。既往研究多聚焦于从健康人群中区分出肺癌患者，而非着重于研究区分良恶性结节，或未深入研究良恶性结节之间生物学差异。因此，在LDCT检测发现IPNs后，采用非侵入性检测手段准确区分IPNs的良恶性对于肺癌临床诊治非常重要。

        研究设计

        从同济大学附属上海市肺科医院共招募了459例患者，并收集其手术前血液样本。去除不符合入组条件患者后，最终纳入109例IPN患者(训练组：47例;测试组：62例)(图1)。训练组中，良性PN患者17例，恶性PN患者30例;测试组中，良性PN患者24例，恶性PN患者38例。

        研究采用思路迪的外泌体分离试剂来分离患者血浆外泌体，利用小RNA测序技术检测患者血浆外泌体miRNAs表达谱，通过LASSO法构建CirsEV-miR诊断模型，在外部验证组99例IPN患者中验证CirsEV-miR模型效能，并采用TCGA(The Cancer Genome Atlas Program，癌症基因组图谱计划)数据库中490例患者的数据进行生存分析。

        图1：研究设计

        研究结果

        1、血浆外泌体特征鉴定

        研究提取IPN患者的血浆外泌体，进一步通过免疫印迹检测(WB)、纳米粒子跟踪分析(NTA)、透射电镜扫描技术(TEM)、免疫荧光染色等技术，明确分离的胞外囊泡主要为外泌体。

        图2：透射电镜下的外泌体.

        2. CirsEV-miR模型构建与验证

        研究通过LASSO回归方法构建CirsEV-miR模型，最后确定基于5个miRNAs(let-7b-3p、miR-101-3p、miR-125b-5p、miR-150-5p和miR-3168)建立的CirsEV-miRNA模型效能最高，AUC达到0.920(图3d)。

        根据CirsEV-miR模型计算打分，发现恶性肺结节患者的CirsEV-miR分值明显高于良性肺结节患者(图3e)。

        图3d：CirsEV-miRNA模型效能;3e：良性和恶性肺结节的CirsEV-miR分值

        3. CirsEV-miR模型miRNA生物学功能分析

        对CirsEV-miR模型5个miRNAs的靶基因进行了GO和KEGG信号通路分析，发现这些靶基因富集于肿瘤发生与进展过程相关的信号通路，例如MAPK、TGFβ、Hippo、p53相关信号通路、细胞周期和胞间黏附等生物学过程。

        此外，通过对TCGA数据库中490例肺腺癌患者数据进行分析，发现miR-101-3p或miR-150-5p与患者总生存相关(图4e，图4f)。

        图4e：肺腺癌患者miR-101-3p总生存分析;图4f：肺腺癌患者miR-150-5p总生存分析.

        4. 血浆外泌体miRNA特征可区分直径≤1 cm的IPNs

        临床上，直径>1 cm肺结节需要切除，而直径≤1 cm肺结节需定期随访。按照肺结节直径是否>1 cm，109例IPN患者被分为两组，比较两组之间CirsEV-miR分值是否存在差异。结果显示，直径>1 cm组CirsEV-miR分值显著高于直径≤1 cm组(图5a)。

        在直径≤1 cm组的IPN中，恶性PN的CirsEV-miR分值也明显高于良性PN(图5b)。在直径≤1 cm的IPN患者中，血浆外泌体miRNA表达谱在良性PN和恶性PN之间也存在差异。

        图5a：直径≤1 cm和直径>1 cm的IPNs患者CirsEV-miR模型分值;图5b：直径≤1 cm的良性PN和恶性PN患者CirsEV-miR模型分值.

        5. 原位腺癌(AIS)/微浸润腺癌(MIA)的外泌体miRNA特征

        原位腺癌(AIS)和微浸润腺癌(MIA)是早期肺癌，与浸润性腺癌相比，患者预后情况更好。109位患者被分为良性结节组(n=41)、AIS/MIA组(n=30)和浸润性腺癌组(n=38)，CirsEV-miR分值在随恶性程度增加而上升(图6a)，血浆外泌体miRNA表达谱也随恶性程度增加而逐步变化，AIS/MIA组CirsEV-miR分值与血浆外泌体miRNA表达谱均介于良性结节组与浸润性腺癌组之间。

        图6a：良性结节、AIS/MIA、浸润性腺癌的CirsEV-miR模型分值.

        研究意义

        总体来说，CirsEV-miR模型可作为一种非侵入性的辅助检测，帮助临床医生区分IPNs，有助于早期肺癌的诊断。CirsEV-miRNAs表达谱的差异，可能在未来的研究中作为潜在的治疗靶点。

        本研究纳入来自三级医院高度怀疑为恶性PN并接受手术的患者(手术后病理诊断可证实)。与既往在低患病率人群中进行肺癌早筛的研究不同，此研究纳入了高患病率患者。与区分结节和非结节相比，区分PN是良性还是恶性更为困难。

        结节为恶性的可能性与其直径呈正相关。IPNs<5 mm，肺癌的可能性较低;IPNs直径在5 mm~10 mm，恶性的风险为中等;IPNs>10 mm，恶性的可能性较大，临床上认为需要手术治疗。本研究结果显示，CirsEV-miR模型有助于区分良恶性，即使对于直径<1 cm的肺结节也是如此，从而扩大了应用范围。

        目前认为，从良性病变，到AIS/MIA，再到浸润性腺癌，是一个逐步进展的过程。有研究报道，EGFR、ERBB2、NRAS和 BRAF突变，以及基因组肿瘤内异质性和免疫编辑，是AIS、MIA和浸润性腺癌的早期现象，而TP53突变、细胞迁移以及转移相关基因，可能是肿瘤进展过程中的后期事件。

        我们的研究结果显示，良性PN、AIS/MIA、浸润性腺癌之间的miRNA表达谱特征存在差异，支持这种逐步进展的假设。AIS/MIA是良性PN和浸润型腺癌的中间状态，有其自身的分子特征。研究结果表明，血浆外泌体miRNA可作为IPN诊断的生物标志物，协助LDCT进行IPN的良恶性评估。

        参考文献

        Identification and evaluation of circulating small extracellular vesicle microRNAs as diagnostic biomarkers for patients with indeterminate pulmonary nodules. J Nanobiotechnology. 2022 Apr 2;20(1):172.