近来有一些研究观察了新冠肺炎(COVID-19)的病理改变以及免疫应答，但缺乏感染时的感染细胞与免疫系统的相互作用。

        本文研究中主要报道的高参数成像质谱流式(imaging mass cytometry，IMC)技术应用，其能够在1μm分辨率下对同一组织切片上超过30种蛋白质的丰度和定位进行评估，可用金属标签的抗体对组织样本的蛋白进行标记，再激光消融感兴趣的区域，每次激光脉冲可使该取样点内的金属标签元素送入质谱法定量，最后利用软件将生成的数字化信号转换为图像。可借助单细胞分辨率研究人类急性肺损伤(包括SARS-CoV-2感染引起的损伤)的细胞组成和空间结构。

        近期研究报道精粹

        1.方法

        调查了23个死亡患者，包括无肺部疾病的个体、流感后ARDS、细菌感染后ARDS、急性细菌性肺炎引起的ARDS以及COVID-19感染后ARDS(图1a)，并将COVID-19患者按照死亡发生在呼吸系统症状开始30天之前或之后，分为“早期”和“晚期”COVID-19患者(图1a)。

        2.结果

        (1)COVID-19患者尸检肺的病理生理学改变

        利用肺部组织切片样本生成237张包含36种生物标志物的IMC图像(图1a)。将IMC数据量化后发现，疾病组肺部重量显著增加(图1b)、腔隙明显减少(图1c, e)以及纤维化评分增高(图1d, f)。

        并将全部单细胞投影到平面后构建了一个单细胞图谱，并根据其表型聚类分为17个元簇(图1g, h)。与健康肺部相比，COVID-19患者肺部巨噬细胞浸润显著增加(图1i)，更详细的表型检测提示巨噬细胞是间质巨噬细胞来源的(图1j)。此外，COVID-19晚期组患者肺部的间充质细胞和成纤维细胞数量增加(图1k)。

        为证实验结果，对同一肺组织免疫组化染色后发现在IMC和免疫组化中标志物阳性的细胞比例一致(图1l)。此外，使用靶向空间转录组学与IMC分析得到的疾病组间细胞类型组分的变化具有良好的一致性(图1m)。

        图1 肺部感染的结构和免疫紊乱

        (a)队列组成及IMC步骤。(b)尸检时测量的肺总重量。(c)每个IMC图像的腔隙空间占图像面积的百分比。(d)每个IMC图像的纤维化评分。(e)肺腔隙和肺实质结构的代表性图像。(f)肺胶原蛋白图像及相关纤维化评分。(g)所有细胞的均匀流形逼近和投影(Uniform manifold approximation and projection, UMAP)，以及分析得到的细胞元簇。(h)元簇中每个标志物的平均强度。(i)免疫细胞的空间分布。(j)左图：各疾病组中性粒细胞(上)和巨噬细胞(下)的丰度。右：巨噬细胞分为肺泡亚群(上)和间质亚群(下)。(k)各疾病组间充质细胞(左)和成纤维细胞(右)的丰度。(l)各疾病组MPO(左)和CD163(右)在IMC(x轴)和免疫组化(IHC)(y轴)间的变化量。(m)用IMC(x轴)和靶向空间转录组学(y轴)对相同(左)或独立(右)队列的COVID-19晚期和早期组之间每一种细胞类型(n=24)的变化量进行估算。对于c、d、j、l、m、n，n=237张来自27个生物独立样本的图像。

        (2)广泛炎症引起的组织损伤

        研究结果显示，SARS-CoV-2 S抗体对COVID-19患者的组织样本具有高特异性(图2a)。在所有细胞类型中，肺泡上皮细胞的SARS-CoV-2 S阳性率最高(图2b)。这些肺泡上皮细胞的pSTAT3、KIT、IL-6、Arginase 1、cCASP3和C5b-C9高度阳性(图2c, d)。

        还可观察到S+细胞的定位具有高度异质性(图2e)：虽然一些S+肺泡上皮细胞与其它细胞相互作用(图2e 右上)，但另一些S+上皮细胞似乎被包裹在一个结构中而不与其它细胞相互作用(图2e 右下)。

        细胞相互作用定量图显示COVID-19晚期，巨噬细胞与成纤维细胞、树突细胞之间的相互作用增加(图2f，g)。同样在图像中可以看到巨噬细胞优先与肺泡壁的成纤维细胞相互作用(图2h)。

        巨噬细胞和中性粒细胞具有高水平的死亡标记cCASP3(图2i)，而上皮细胞和内皮细胞则具有攻膜复合物C5b-C9(图2j, k)，这可能表明细胞凋亡和补体介导的免疫防御，导致肺泡损伤。

        图 2 SARS-CoV-2感染的细胞趋向性

        (a)肺S+细胞丰度。(b)COVID-19患者S+细胞在元簇中的分布。(c,d)COVID-19肺泡上皮细胞表型取决于S蛋白水平。(e)S信号在空间环境中的分布。(f, g)COVID-19和健康肺部之间细胞互作的差异，COVID-19早期和晚期之间细胞互作的差异。(h)COVID-19早期和晚期的成纤维细胞和巨噬细胞。(i, j)每一疾病组cleaved CASP3+巨噬细胞或中性粒细胞的比例，C5b-C9+上皮细胞或内皮细胞的比例。(k)COVID-19和健康肺部肺泡上皮细胞C5b-C9的沉积。对于a、i、j，n=237张来自27个生物独立样本的图像。

        (3)一个可解释的肺病理谱

        主成分分析(principal component analysis, PCA)的主轴是驱动图谱建立的主要因素，该肺病理谱的建立主要由健康和晚期COVID-19患者肺部样本之间的差异所主导(图3a)。例如，巨噬细胞在COVID-19肺部中最丰富，以及胶原在COVID-19肺部沉积(图3b)。

        为了增加肺病理谱的临床可解释性，该研究将主轴与患者的临床、病理和人口统计学因素进行关联分析，可以观察到临床因素和第一主成分(PC1)之间存在密切联系(图3c)。将临床因素数值的图像分别与图a重叠，呈现出具有临床信息注释的肺病理谱(图3d)。

        为了深入肺病理谱的临床解释，该研究将相关的临床、病理和人口统计学变量根据它们在解释IMC数据方面的相似程度进行两两关联，可以发现变量被分为三组，这些组可能代表了急性早期死亡到慢性病程的病理进展过程(图3e)。其中组1是高敏C反应蛋白和白细胞，代表肺泡壁的急性炎症;组2是高的IL-6、红细胞沉降率、D-二聚体、合并症(如肥胖、高血压)，与微血栓、伴有巨噬细胞的慢性肺泡炎症以及死于脑出血相关;组3是长病程、气管插管及治疗时间长，与鳞状细胞增生，大血栓、机化性肺炎和与成纤维细胞相关的肺泡2 型细胞等相关联。

        图3 数据驱动和临床注释的肺病理谱

        (a)所有IMC图像的主成分分析。点代表图像。箭头是每个细胞簇的向量，表示每种细胞类型最丰富的区域。(b)疾病组的显微解剖和免疫成分。(c)火山图显示临床参数与PC1之间的相关性和显著性。(d)临床参数投影到二维PCA上。(e)IMC数据图谱的相似性。与主成分相关的人口统计学、临床和病理变量的两两相关性。矩阵的行和列是一样的。星号表示入院时测量。

        我的观点

        1、该研究主要发现：(1)与健康肺相比，所有疾病组的肺泡腔隙显著减少，免疫浸润和凋亡介导的细胞死亡增加;(2)中性粒细胞和巨噬细胞浸润分别是细菌性肺炎和COVID-19的特征;(3)SARS-CoV-2主要感染肺泡上皮细胞，并诱导与肺损伤相关的局部高炎症细胞状态;(4)高度炎症、间质巨噬细胞浸润、补体激活和纤维化是COVID-19晚期患者的主要特征。随着COVID-19疾病的进展，巨噬细胞外渗增加，间充质细胞和成纤维细胞数量增加，这些细胞类型之间的相互作用增加，可能是试图修复受损肺组织的结果。

        2、IMC较传统流式有两大优点：(1)利用金属元素标签抗体取代传统荧光素标签抗体，可以同时检测数十种蛋白质及其丰度;(2)利用激光消融和数字成像技术，可以记录组织切片中细胞表型的空间位置信息。因此，IMC有助于免疫表型研究，以确定复杂的细胞类型、它们的相互作用和定位。另外，IMC可以使罕见组织样本的价值得到最大程度的发掘。

        3、近期多项研究提出了COVID-19在疾病进展中的潜在病理生理学机制，其机制十分复杂，包括病毒的直接致细胞病变作用、ACE2失调、细胞因子风暴以及血栓形成等。COVID-19免疫病理学的研究为COVID-19不同疾病阶段的治疗方案提供了理论依据，从疾病早期的抗病毒药物，到疾病晚期的免疫调节、抗氧化和抗血栓治疗。然而这一研究获得的COVID-19免疫病理学的信息仍然有限，需要进一步验证和发现。

        参考文献

        1. Rendeiro AF，Ravichandran H, Bram Y, et al. The spatial landscape of lung pathology during COVID-19 progression.Nature 2021;593(7860)：564-569. 10.1038/s41586-021-03475-6