01

研究背景

生物医学和临床研究人员试图从不同的角度定义人类严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染的不同阶段。通常认为，感染的初始阶段出现病毒血症或免疫应答决定机体保持健康与否，此阶段约持续1周。随后为肺炎阶段，通常在初次感染后持续不超过3周。此后恢复期开始，在此期间感染消退，患者恢复健康。

然而，越来越多的证据表明SARS-CoV-2感染存在一个延长的恢复过程，即使对非住院患者也是如此，这一阶段中可监测到慢性症状且可能出现疾病复发，称为长期冠状病毒病(COVID)或急性期后COVID。目前，此阶段的持续时间有待探究。

为阻止和控制2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019, COVID-19)大流行，全球范围内已经开始大力开发疫苗和抗病毒化合物。为了实现这些挑战性目标以及获得了解感染模式及其病理学相关的基本知识，动物研究至关重要。COVID-19研究中使用最广泛的两种非人类灵长类动物(non-human priamtes，NHP)猕猴是恒河猴和食蟹猴，这两种猕猴已在SARS和MERS研究中发挥了突出的作用，也被认为是临床前COVID-19研究的NHP模型。

02

对象与方法

本文重点研究恒河猴与食蟹猴轻至中度SARS-CoV-2感染病程中急性期后的前几周。对两种成年雄性猕猴(各4只)以相同病毒载量和相同剂量平行感染，并接受完全相同的治疗。使用相同的方法跟踪感染过程6周，跟踪监测两种猕猴体内SARS-CoV-2病毒复制情况及COVID-19样临床症状，连续遥测记录动物的体温和身体活动，利用CT和 PET-CT监测病毒诱导的代谢和解剖结果。研究中处死实验动物以探究与SARS-CoV-2相关的组织病理学变化及病毒在器官中的传播。

03

结 果

(一)猕猴感染SARS-CoV-2

图1 SARS-CoV-2感染后猕猴拭子样本病毒载量

采用qRT-PCR方法对恒河猴和食蟹猴气管和鼻拭子中的病毒RNA和亚基因组信使RNA进行定量分析;图中红色系标识为恒河猴，蓝色系为食蟹猴;因感染14天后检测不到病毒RNA未展示。

研究发现经气管和鼻部接种病毒后第1天，在所有实验猴的气管和鼻拭子中均可检测到病毒RNA。通过图1G、H发现，在鼻拭子中检测到的峰值病毒载量一般低于气管样本，不超过9.5×104 GE/mL(R15090; 感染后第1天)。此外，SARS-CoV-2病毒RNA水平个体差异大。在感染后的前两天测量到的高RNA载量表明，从原始接种物中提取的RNA仍然存在。值得关注的是，8只动物中有5只鼻拭子中病毒RNA在一天或几天无法检测到后复阳。图E中食蟹猴J16017第1天的鼻拭子检测呈阳性，后续3天内未检测到病毒RNA，但后来该动物复阳持续6天。

病毒亚基因组信使mRNA(subgenomic messenger RNA, sgmRNA)可作为病毒复制的证据，实验中仅在气管拭子中检测到。除了鼻拭子标本，在肛门拭子或血液样本中亦未检测到sgmRNA，这表明在实验动物的血液和肠道中没有活跃的病毒复制。

(二)SARS-CoV-2感染后的体温、活动度、临床症状及血液相关指标

图2 累积活动度评分

与实验后期的时间点相比，两种猕猴的体温在感染后前两周均明显升高，并在经过感染初期阶段后回落。

研究者利用遥感装置监测猕猴活动度，实验猴每周的累积活动度评分通过曲线下面积(area under the curve, AUC)计算得出(图2)。如图所示，与感染SARS-CoV-2后第1周的累积活动度相比，4只恒河猴感染后第3周的累积活动度评分明显提高，反映出病毒对于动物一般活动存在影响。在研究的第4、5周，恒河猴的累积活动度评分再次降低。此外，在感染病毒后5周中，观察到食蟹猴的累积活动度评分未受影响，体现出SARS-CoV-2感染后机体反应性存在物种相关性差异。

此研究中采用的临床症状评分表从以下方面每周进行评分：整体状况、皮肤和毛发状况、头颈部器官状况、呼吸系统状况、食物摄入情况、运动情况。感染病毒后第1周，4只恒河猴与两只食蟹猴评分略低，另外两只食蟹猴评分略高，但差异无统计学意义。此后数周中，8只实验猴的临床症状变化均未表现出与COVID-19相关。

猕猴血标本相关实验结果与已报道的COVID-19患者血标本相关生化指标改变不同。已有相关研究表明，与健康人相比，COVID-19肺炎患者体内C反应蛋白的水平升高。在一个COVID-19患者队列中，10%～15%的患者体内血清肌酐与血尿素氮水平上升，出现急性肾损伤。另外，由于感染后机体处于凝血功能紊乱状态，亦有研究表明患者体内D-二聚体水平明显上升。因此，研究对于猕猴血标本中的C反应蛋白、血清肌酐、血尿素氮、D-二聚体均进行测定，以未被病毒感染的健康猕猴作为对照组，发现以上指标在感染病毒后的猕猴体内均未上升，仅葡萄糖和谷丙转氨酶水平在感染后第一周上升。

(三)SARS-CoV-2感染诱导体液免疫应答

图3 恒河猴与食蟹猴SARS-CoV-2感染后相关抗体水平变化

*DR-ELISA结果为S/P：样本与阳性对照比，计算公式如下：

感染病毒后，对病毒刺突蛋白(S)和核蛋白(N)等蛋白组分的体液免疫相关指标易被检测到(图3)。特异性结合刺突蛋白外功能区的IgG滴度可在感染后6～8天初次检测到。随后IgG滴度持续上升，约4周后达到稳定水平。食蟹猴IgG水平的组内差异大于恒河猴的IgG水平。与恒河猴相比，检测到食蟹猴IgG的时间略早，但差异无统计学意义。

此外，研究还分析了结合受体结合域(receptor binding domain, RBD)IgG水平变化情况，发现抗RBD IgG完全反映了IgG与全长型S蛋白的结合过程。检测结合全长型S蛋白及RBD IgM(补充图S5)，发现可测的IgM滴度与IgG滴度在感染病毒后的相同时间点出现。总体而言，除R15090外，食蟹猕猴的IgM滴度均高于恒河猴。

补充图S5 恒河猴与食蟹猴体内抗SARS-CoV-2 IgM滴度变化

接着，此项研究还检测了对病毒核蛋白(N)的抗体反应。采用DR- ELISA法检测血清中的总免疫球蛋白(Ig)，免疫反应于感染后第10天至第12天之间逐渐显著。大多数恒河猴和食蟹猴体内的免疫球蛋白在第12天至第23天间达到峰值(除Ji0408005，第30天达峰)。

通过直接结合N蛋白的IgG反映总免疫球蛋白的变化情况。值得注意的是，在纵向监测过程中，血清样本抗N蛋白的IgM滴度几乎无法测到，仅在食蟹猴J16012中瞬时检测到IgM滴度(补充图S5)。

(四)SARS-CoV-2感染猕猴血清中细胞因子与趋化因子检测

图4 SARS-CoV-2感染后外周血中的细胞因子和趋化因子水平

研究者通过检测两种猕猴外周血中13种细胞因子和趋化因子，发现SARS-CoV-2引发的炎症反应可大致分为两个阶段。第一阶段为IP-10、IL-6、MIP-1α、MIP-1β和IFN-γ水平的短暂下降期而其他炎症指标水平较为稳定(包括Eotaxin、TNF-α和IL-8)。其中，IP-10与RANTES水平在两种猕猴间存在差异。此外，RANTES水平变化提示炎症反应的第二阶段。食蟹猴血清中RANTES在感染SARS-CoV-2后迅速下降，并在观察末期回落至正常水平。恒河猴血清中RANTES水平于感染早期出现过短暂降低，在感染后第8天恢复正常水平，随后再次下降，至观察期末恢复正常水平。

(五)SARS-CoV-2感染期间肺部病变与淋巴结活化过程

表1 SARS-CoV-2感染猕猴肺部病变CT评分

图5 累积CT分数(根据表1所示的CT评分计算)

对感染病毒后的猕猴进行胸部CT检查发现，随时间推移出现许多COVID-19疾病表现以及肺部受累。最常见的病损为磨玻璃样结节、肺实变和铺路石征。在感染病毒2天后的第1次CT检查中，3只恒河猴和2只食蟹猴出现肺部病损。此后，大部分实验动物出现肺部受累且CT评分上升，至感染后第8天和第10天所有猕猴出现肺部损害。

PET-CT显示，所有猕猴在每个时间点至少有一个气管支气管淋巴结的代谢摄取增加，且与摄取增加相关的淋巴结体积为27~2 350mm3(平均值620mm3，标准差534mm3)(淋巴结体积大于等于194mm3时可定义为淋巴结肿大);研究还发现，淋巴结体积减小时伴随代谢摄取峰值的下降。

图6 SARS-CoV-2感染后J16017气管支气管淋巴结的病变情况和代谢活动的纵向进展

图6呈现的是不同时间点J16017食蟹猴厚度为3mm的代表性冠状切片。病毒感染后第0天和第4天只进行CT检查，随后直至第35天，进行PET-CT检查，两者图像整合。用白色箭头标出病变部位，图中可见不同时间点病变部位存在差异，且在第35天病变极为明显定位于左肺。

(六)大体病理学(肉眼病理学)

研究者称，从宏观上看，恒河猴和食蟹猴的肺部病理表现大多不显著。其中，一只恒河猴(R15096)在左、右肺叶尾端很少有小病灶充血，而3只食蟹猴肺部有类似的充血灶，也局限于尾端肺叶。肺外器官大体检查显示猕猴颈部和肠系膜淋巴结中度增大。其余器官病理改变在宏观上不显著。

(七)死后组织中广泛存在病毒RNA且证实病毒感染后猕猴呼吸道内病毒复制活跃

图7 感染恒河猴(R14002)和食蟹猴(J16012、J16017和Ji408005)组织中病毒RNA载量

*L, left,左侧; R, right,右侧; LN, lymph node，淋巴结; UR, upper right lung lobe，右肺上叶; AR, accessory right lung lobe，右肺副叶; MR, middle right lung lobe，右肺中叶; LR, lower right lung lobe，右肺下叶; UL, upper left lung lobe，左肺上叶; ML, middle left lung lobe，左肺中叶; LL, lower left lung lobe，左肺下叶。)通过qRT-PCR检测计算每克组织中病毒RNA载量。图7中仅展示组织中病毒RNA阳性的恒河猴(R14002)和食蟹猴(J16012、J16017和Ji408005)。

qRT-PCR实验结果显示(图7)，病毒RNA阳性猕猴的阳性组织数量存在很大差异。食蟹猴J16012和Ji408005仅呼吸道组织结果呈阳性。其中，Ji408005的咽黏膜、肺和两个肺淋巴结组织呈阳性，而在J16012的气管隆突、肺和4个肺淋巴结中检测到病毒RNA。此外，在另外两只阳性猕猴(R14002与J16017)组织中，呼吸系统及气管支气管淋巴结中病毒RNA阳性，但在已知的人类感染SARS-CoV-2后的靶器官与组织中，如颈部淋巴结、肠系膜淋巴结、皮肤、结膜、肝脏、脾、脏、肾脏、唾液腺和心脏中亦检测到病毒RNA。

表2 每克组织内sgmRNA定量检测

SARS-CoV-2复制伴随其sgmRNA的合成，因此研究者对所有测得病毒RNA阳性组织进行sgmRNA PCR实验，以实现从组织中分离病毒的。研究发现尽管在超过26天(R14002)、30天(J16017)甚至34天(J16012和Ji408005)时4只猕猴的鼻和气管拭子中不再检测到病毒，但sgmRNA在4只猕猴的呼吸道组织中均检测到sgmRNA，有力地证明在鼻拭子及气管拭子样本检测阴性后，即SARS-CoV-2感染消除后，SARS-CoV-2仍继续复制。

(八)组织病理学

图8 感染SARS-CoV-2恒河猴与食蟹猴组织的组织病理学变化(感染后36天至42天)

猕猴组织学检查中出现的不显著或恢复的小病灶是SARS-CoV-2既往感染的证据。两种猕猴的病变特征相似，包括如下特征：局部有少量至轻度间质单核炎症浸润、细支气管平滑肌增生(图8A-2)、血管充血、肺泡间隔多灶性轻度扩张伴胶原纤维沉积(图8A-3)，偶尔出现II型肺细胞增生和肺泡内巨噬细胞(图8A-4)，接着通过抗TTF-1抗体免疫组化实验证实这一发现(图8A-4右上角插图)。食蟹猴J16017结膜显示固有质多灶和血管周围中度淋巴细胞浸润(图8C -2)，PET-CT图像验证了这一发现(图8C)：与J16017的右眼相比，左眼FDG摄取增加，表明正在进行SARS-CoV-2诱导的发病过程。这与PCR结果一致(图7)，清楚地说明SARS-CoV-2感染后J16017的眼部病损。此外，同一动物的颈部淋巴结表现出明显的淋巴样增生(滤泡型)(图8B-1右下角插图)。与结膜相似，在该淋巴结中亦检测到SARS-CoV-2 RNA。恒河猴R14002组织中，肠系膜淋巴结PCR阳性提示SARS-CoV2感染，组织学表现为明显的淋巴样增生-皮质旁型(图8B-2)。

04

研究结论

猕猴感染SARS-CoV-2急性期后病毒RNA与sgmRNA提示病毒持续复制，病毒在死后肺组织、眼结膜、颈部淋巴结、肠系膜淋巴结等多种组织中广泛存在且复制活跃，为进一步探究COVID-19病后对人类健康状况的长期影响提供线索。

05

我的观点

1. 研究中采用qRT-PCR方法检测不同部位拭子及组织样本中的SARS-CoV-2病毒RNA及sgmRNA载量。其中，气管拭子峰值病毒载量高于鼻拭子，sgmRNA仅在气管拭子中检测到，体现出SARS-CoV-2病毒的深部气道定植倾向，这与已知的SARS-CoV-2病毒攻击气道与肺泡引起深部气道损伤一致。

2. 以未被病毒感染的健康猕猴作为对照组，检测猕猴血标本中的C反应蛋白、血清肌酐、血尿素氮、D-二聚体，发现这些指标在感染SARS-CoV-2后的猕猴体内均未上升。而以上指标均为已经报道的COVID-19患者血标本中病后改变的相关生化指标，在排除实验误差的可能性后，可以认为SARS-CoV-2感染后机体生化指标变化情况存在物种特异性。

3. 研究发现猕猴死后组织中广泛存在病毒RNA。值得注意的是，SARS-CoV-2 RNA检测阴性的呼吸道组织中检测sgmRNA仍为阳性，提示病毒持续复制，但此时复制活性较低。目前，存在核酸阳性患者核酸检测转阴后复阳的情况，在本文研究的基础上，推测此类核酸转阴患者体内sgmRNA仍为阳性，于核酸转阴后接触某些刺激促使sgmRNA水平再次上升，病毒RNA水平上升，病毒复制活性增强，促使核酸检测复阳。

参考文献

1. Böszörményi KP, Stammes MA, Fagrouch ZC, et al. The Post-Acute Phase of SARS-CoV-2 Infection in Two Macaque Species Is Associated with Signs of Ongoing Virus Replication and Pathology in Pulmonary and Extrapulmonary Tissues. Viruses 2021;13(8):1673

MCC号Xo92111190有效期2022-11-03，资料过期，视同作废。