在既往研究中，对健康个体的单细胞RNA测序(scRNA-seq)揭示了SARS-CoV-2受体蛋白的组织水平分布[1, 2];而对不同严重程度的新冠肺炎患者行支气管肺泡灌洗液以及血液样本检测发现SARS-CoV-2感染对免疫反应及细胞因子调控的影响[3-6]。然而，SARS-CoV-2感染引起的肺组织水平宿主反应尚不明确。

snRNA-seq(单核RNA测序)相对依赖于活细胞的scRNA-seq适用范围更广，可以对珍贵的冷冻样品进行单细胞水平的生物学分析。现今由 SARS-CoV-2病毒所引发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)已呈全球流行之势，约15%的感染者将发展至高死亡率的重症。

本文推介实验研究为加深对 COVID-19幸存者长期并发症的理解，并为将来针对COVID-19的治疗提供基础。预设流程如下：首先对新冠重症患者死亡后数小时内行尸检(19例)，将所获肺组织以急冻的方式保存，并匹配正常对照(7例于新冠疫情爆发前经由肺切除术或活检取得肺组织样本)(图1a，左);而后采用snRNA-seq技术行细胞及蛋白水平的验证(图1a，中);在确定snRNA-seq中各分群的细胞类型后，进行下游的差异表达基因、细胞通讯分析及潜在的药物靶点预测(图1a，右)。

主要结果解读

1. COVID-19背景下肺组织的细胞景观

对质控合格的116314个高质量细胞核表达谱进行聚类后，得到若干免疫细胞分群，使用UMAP(uniform manifold approximation and projection)降维方法展示其在低维空间的分布(图1b);相同的分布情况也用于展示细胞来源(源于正常肺组织或新冠肺炎感染组织，图1c)。在组织水平的比较中，成纤维细胞、髓系细胞、神经元细胞的比例在COVID-19肺组织中较正常对照显著上升(P < 0.05);反之，抗原呈递细胞(APC)和上皮细胞则显著下降(P< 0.05)(图1d)。

图 1

2. 髓系细胞被异常激活

得出初步结果后，聚焦免疫细胞。图2a中去除了非免疫细胞的标签和颜色(如成纤维细胞，平滑肌细胞等)，重点展示免疫细胞的分群情况。图1d示髓系细胞的比例在COVID-19肺组织中显著上升，图2b的扩散成分分析示单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages，MDMs)、过渡态MDM(transitioning MDMs)以及肺泡定居巨噬细胞(resident alveolar macrophages，AMs)呈现了明显不同的发育轨迹。增补图S5a示，相对正常组织而言，巨噬细胞异常激活的标志物(含CTSB，CTSD，CTSZ，PSAP等)在COVID-19肺组织中的MDMs高表达。如图2c所示，AMs在COVID-19肺组织中显著富集;图2d免疫荧光显示，在COVID-19肺组织AMs中，肿瘤相关的巨噬细胞受体AXL在蛋白水平表达显著下降，这与图S5b中的AXL转录水平变化趋势一致。AXL是一种受体酪氨酸激酶，在胞葬作用(吞噬细胞将程序性死亡的凋亡细胞移除的过程)及组织再生期间的抗炎症调控过程中起到关键作用[7]。这说明髓系细胞是COVID-19炎症反应失调的重要因素。

3. 血浆及T细胞反应

进一步研究肺组织中针对 SARS-CoV-2 感染的体液免疫反应。通过在单细胞层面分析免疫球蛋白重链(IGHV)和轻链可变区(IGLV)基因的mRNA 共表达情况来推测免疫球蛋白类型并鉴定浆细胞。图2e展示了前20个IGHV–IGLV组合的发生频率及相应的组织分布(仅在对照组出现/仅在COVID-19组出现/两组中均出现)(图2f)。图2e中星号标注了IGHV1-18–IGLV3-20组合，该组合能够产生靶向SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域 (RBD) 的中和抗体S309 [8]，且仅出现于COVID-19组织中(图2f)，表明感染后引起了机体针对性体液免疫反应。在对T细胞、NK细胞精细分群后，鉴定出CD8+T 细胞、Treg细胞、CD4+细胞和NK细胞(图2g)。图2h，i显示了GZMB(细胞毒性基因)和 MKI67(细胞周期/增殖基因)仅在部分T细胞分群中表达升高。这说明在体液免疫能力尚存的患者中，T细胞应答能力受损可能是COVID-19致死的原因之一。

图 2

图 S5

4. 肺泡上皮再生能力受损

在上皮细胞分群中，进一步鉴定出肺泡上皮细胞(含一型肺泡细胞AT1和二型肺泡细胞AT2)、气道上皮细胞(含基底细胞、纤毛细胞、棒状细胞、杯状细胞及黏液细胞)。此外，还鉴定出一个以炎症及细胞周期相关基因(IRF8，B2M，MKI67，TOP2A)为特征的循环上皮细胞群(cycling epithelium)和高表达细胞外基质 (ECM，高表达COL6A3、COL1A2和COL3A1) 的ECM高表达上皮细胞群(ECMhigh epithelium);以上分群对应的组织分布见图3b。在肺再生过程中，AT2细胞是AT1细胞的前体[9]，值得注意的是，虽然这两种细胞在按细胞分群注释的UMAP图中呈现明显的分群(图3a)，但在按细胞来源注释的UMAP图(图3b)中，AT1/AT2之间的离散程度在COVID-19组中较正常对照为低(两者间分群不明显)。图3c中，每行代表一个基因，每列代表一个样本，左上侧粉色/紫色侧栏表示AT1/AT2的标志基因，左下浅红色侧栏表示差异基因(AT1相对于AT2差异表达)，可以看出，差异基因和标志基因在COVID-19-AT1和COVID-19-AT2之间的差异较相应对照组(Control-AT1和Control-AT2之间)并不明显。由于ETV5表达不足将导致AT2细胞向AT1分化，该基因被认为是AT2细胞保持自身细胞身份的转录因子[10]，根据图3d，COVID-19组中AT2细胞的ETV5表达量较对照显著下降，表明AT2细胞的再生修复机制已被触发(AT2转化为AT1，后者再参与到肺泡再生的过程中)。CAV1是AT1细胞晚期成熟的标志基因[11]，根据图3e，其表达量在COVID-19肺组织中AT1细胞较对照显著降低。这说明在COVID-19肺组织中，虽然再生修复机制已经启动，但AT2未完成向AT1的彻底转化。

近期研究表明炎症可以诱导一种无法完全转化为AT1细胞的状态，称为“损伤相关的瞬态前驱细胞”(damage-associated transient progenitors，DATPs)。以DATP 标志基因(KRT8、CLDN4和CDKN1A)[12]表达水平为特征从AT细胞群中进一步定义DATP亚群(图3f)。图3f的嵌入图及图3g说明，COVID-19肺组织中的AT细胞表达较对照具更强的DATP特征。图3h扩散成分分析展现了AT2和AT1间明显不同的发育轨迹，而DATP位于两种状态之间，且DATP vs. AT细胞的比例在 COVID-19 肺组织中高于对照(图3i)。相应组织的免疫荧光染色显示 KRT8+和CLDN4+的DATP在COVID-19肺组织中的占比高于对照(图3j)。这说明，除了病毒感染对肺泡上皮产生的直接破坏，COVID-19 患者的肺再生(修复)功能也受到一定程度的损伤。

接下来进一步确定导致 DATP 这一细胞状态的原因。研究人员对已发表的成像质谱流式细胞数据集[13]行进一步分析，该数据集包含 23 个体(包括健康对照，流感肺炎，细菌性肺炎，急性呼吸窘迫综合征以及10名死于COVID-19的患者)237个特定组织区域的蛋白水平表达谱。分析结果(图3k)表明，COVID-19患者中单核细胞和巨噬细胞的IL-1β表达量高于正常对照;图3i表明另一个关键的炎症性细胞因子IL-6，在COVID-19患者上皮细胞的表达量较其余各组显著升高，但就巨噬细胞而言，与其他疾病组患者相比，COVID-19组并没有差异性表达IL-6。这表明，相较于其他由病毒或细菌引发的肺炎，髓源性IL-1β可能是 COVID-19 肺组织中的独特标志。由于IL-1β有助于介导和保持 DATP这一细胞状态，可能是导致COVID-19肺泡上皮再生障碍的原因。

图 3

5. 性成纤维细胞和肺纤维化

图1d示COVID-19肺组织中的成纤维细胞数量显著多于对照。图4a表明纤维化程度与疾病持续时间相关，COVID-19 中肺纤维化随时间增加。确定了5种成纤维细胞亚型：肺泡成纤维细胞(Alveolar FB)、外膜FB (adventitial FB)、病理性FB (pathological FB)、中间病理性FB (intermediate pathological FB，pFB) (图4b)。

pFB在小鼠模型、特发性肺纤维化或硬皮病患者中，是导致肺纤维化的主要因素。如图4c所示，pFB在COVID-19组织中占比明显增加，这表明 pFB是 COVID-19 患者肺纤维化快速进展的原因。

图 4

结 论

(1)在COVID-19 肺组织中，源自单核细胞的巨噬细胞以及肺泡巨噬细胞被异常激活;

(2)虽然在COVID-19患者中体液免疫正常，但 T细胞应答缺失;

(3)相较于其他类型(细菌/病毒性)的感染，源于单核细胞/巨噬细胞的IL-1β以及源于上皮细胞的IL-6可能是SARS-CoV-2感染的独特标志;

(4)在COVID-19肺组织中，AT2细胞虽然启动了再生程序，但由于被阻滞在DATP状态，未能完全转变为修复型的AT1细胞，导致肺泡无法充分再生;

(5)病理性成纤维细胞在COVID-19肺组织中大量累积，随时间推移造成肺纤维化。

我的观点

1. 本文列示的COVID-19患者肺组织中，T细胞应答受损。具体来说，在增补图7h，i中，与对照组比较，GZMB在COVID-19肺组织CD4+和CD8+细胞中的表达量仅略微升高(CD8+T细胞)或几乎没有改变(CD4+T细胞)，说明这两组细胞群并未在病毒面前展现应有的细胞毒性效应。由于Notch2通过直接调控GZMB启动子区活性促进其表达，进而影响细胞毒性T细胞的增殖分化[14]，这使得对Notch信号通路的激活成为潜在的COVID-19免疫治疗方案。

2. 根据文中的图3a，b，AT2和AT1细胞在COVID19组织中的丰度相较于对照均显著下降，说明AT2到AT1的转化不仅受阻，AT2本身的再生可能也受到了影响。因此，提高AT2细胞的丰度可能有助于COVID-19感染后的肺组织修复。动物实验表明，气管内给药，角质形成细胞生长因子(KGF)[15]、肝细胞生长因子(HGF)[16]等AT2细胞分裂素有助于刺激AT2细胞的增殖，但目前尚不明确由此增殖的AT2细胞是否也会被阻滞在DATP阶段。尽管如此，仍为COVID-19的治疗提供了一条思路。

3. 研究观察到，COVID-19患者不仅肺修复功能受损，还伴有随时间进展的病理性肺纤维化，值得注意的是，在肺上皮细胞受损后，如修复能力不足，成纤维细胞会被激活，导致受损处被纤维组织替代。因此抑制感染后导致的肺纤维化可能改善COVID-19患者的长期预后。本文研究中pFB(病理性成纤维细胞)中JunB和JunD活性升高，它们在动物模型中，可以通过激活TGFβ和STAT3信号通路介导肺纤维化[17]。研究最后预测，在pFB中，MMP14活性提高(补充材料图12j)，有可能作为针对pFB的潜在药物靶点。但近期研究指出，MMP14有潜在抗纤维化作用，在特发性肺纤维化中MMP14表达的升高可能是由于其抗纤维化能力被周围强力促纤维化的环境所埋没[18]。因此，仍应谨慎对待针对MMP14的药物研究。

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