嗜酸性粒细胞源性神经毒素

        哮喘是一种异质性疾病，包括很多种临床表型和分子内型，并且在治疗反应上存在明显的个体差异，因此亟需新的精准医学方法来识别和治疗这些临床亚群。

        嗜酸性粒细胞源性神经毒素(eosinophil-derived neurotoxin，EDN)是嗜酸性粒细胞活化后释放的一种具有广泛抗病毒和抗菌活性的RNA酶并能激活炎症细胞参与哮喘的病理过程，可作为哮喘患者嗜酸性粒细胞活化和脱颗粒的生物标志物。大量研究证据表明EDN可用作诊断和监测哮喘的生物标志物，其与哮喘严重程度、气道高反应性以及哮喘急性加重密切相关。此外，EDN水平可用来监测疗效和哮喘控制情况。研究发现经布地奈德和贝那利珠单抗治疗后，EDN水平降低。

        但要准确地解释任何生物标志物数据，首先应了解可能会影响生物标志物稳定性的分析前因素和可能存在的自然生物变异。因此，本文介绍研究旨在确定EDN在全血和血清中的稳定性、正常参考值范围、吸烟和特应性的影响、昼夜节律的影响以及几种主要炎症细胞中EDN的水平。

        对象与方法

        根据120位健康志愿者的EDN水平确定血清EDN参考值范围。另招募了18~75岁的其他受试者进行时间、吸烟和特应性相关研究。

        健康受试者无嗜酸性粒细胞增多的疾病史(包括高嗜酸性粒细胞综合征、嗜酸性粒细胞性肉芽肿性血管炎、嗜酸性粒细胞性食管炎/胃炎)并排除过去1个月内接受口服糖皮质激素治疗或6个月内接受抗嗜酸性粒细胞治疗的受试者。

        非吸烟者的吸烟史<1包年，吸烟者的吸烟史≥10包年。

        特应性受试者至少对3种常见过敏原(猫毛、尘螨和草)中的1种过敏，表现为皮肤点刺试验阳性(皮疹直径≥3mm)。

        哮喘患者至少于研究前12个月经医生诊断为哮喘，需要使用以下药物治疗：

        (1)单独使用SABA或低剂量ICS(<250μg氟替卡松干粉制剂或等效每日总剂量)+缓解药物。

        (2)低剂量ICS(100~ 250μg氟替卡松干粉制剂或等效每日总剂量)+LABA ±茶碱、孟鲁司特;或中剂量ICS(250~500μg氟替卡松干粉制剂或等效每日总剂量)+一个缓解药物。

        该研究纳入的轻度和中度哮喘患者各50%，包括特应性18人。所有的哮喘受试者在研究前12个月和研究期间无急性加重，平均哮喘控制问卷(ACQ6)得分为0.62。

        结果及结论

        分析前变量评估

        (1)通过检测EDN在不同聚丙烯样本管中储存后的回收率，发现样本EDN浓度在5种样本管中储存后的变异率相对较低，变异系数为1.5 ~7.6%(表2)。

        (2)全血样本EDN水平24小时内没有变化，72小时后从基线9.2 ng/mL (±2.3)上升到48.9 ng/mL (±13.0)(图2A)，相对增加了5.3倍(P<0.001)。相反，血清样本EDN水平在室温下从基线26.5 ng/mL (±11.0)到第7天26.0 ng/mL (±10.1)没有明显变化(相对平均下降0.8%，95%CI -3.6%-5.4%，图2B)。冷藏血清同样稳定7天 。

        (3)为了进一步评估血清EDN的稳定性，使样品经历3次冻融。如果样本EDN浓度与血清制备时、冷冻前的基线值相比变化在±15%以内，则认为样本是稳定的。在该标准下，样品在-20˚C或-80˚C下可稳定保存12个月(表3)。

        血清EDN参考区间

        该研究测定了60例男性和60例女性的血清EDN，男性的参考区间为2.10 ~26.10 ng/mL，女性为1.98 ~25.71 ng/mL。男性和女性共同的参考区间为1.98 ~ 26.10 ng/mL。

        特应性和吸烟对健康受试者嗜酸性粒细胞和EDN水平的影响

        在吸烟和特应性的4种不同组合中(图3)，所有人的平均嗜酸性粒细胞和EDN水平是相当的，除了非吸烟特应性受试者嗜酸性粒细胞较高，均值差异有显著趋势(P = 0.07)。在健康非吸烟受试者中，无论有无特应性，嗜酸性粒细胞和EDN水平强相关，对于无特应性受试者Pearson相关系数r = 0.85，95% CI 0.65- 0.94 (P < 0.0001)，对于特应性受试者r = 0.82，95% CI 0.60-0.93 (P < 0.0001)。相反，吸烟者的嗜酸性粒细胞和EDN水平存在较低的相关性，无特异性受试者r = 0.46，95% CI 0.03-0.75 (P = 0.03)和特应性受试者r = 0.35，95% CI 0.11-0.68 (P = 0.13)。

        轻/中度哮喘患者嗜酸性粒细胞和EDN水平的昼夜节律变化

        为了评估血嗜酸性粒细胞和血清EDN水平在一天中的时间差异，在24小时内每4小时对受试者进行一次血液采样。轻/中度哮喘患者的血嗜酸性粒细胞水平呈现昼夜节律，夜间和清晨显著升高(图4A)，在00:00时达到峰值，平均EOS细胞数为281个/μL，与12:00平均EOS细胞数相对比为1.59，95% CI1.33-1.90 (P < 0.001)。健康受试者也表现出EOS的时间差异，但在00:00与12:00的相对比值较小，为1.35，95% CI 1.05-1.73 (P = 0.018)。哮喘组和健康组均未发现明显的EDN昼夜节律，除哮喘组04:00的平均值比健康组12:00的平均值相对比为1.22(图4B)，95% CI 1.02-1.45 (P = 0.027)。

        不同细胞EDN表达水平的比较

        研究人员首先基于转录组数据库(proteinatlas.org, gtexportal.org and blue-print-epigenome.eu)分析了不同细胞的EDN的mRNA水平，并选择了可能是EDN来源的几种细胞(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、干细胞和巨噬细胞)作为研究对象。通过检测以上几种细胞裂解液中的EDN浓度，发现嗜酸性粒细胞中的EDN浓度比其他几种细胞高约200倍，提示嗜酸性粒细胞是血液中EDN的主要来源(图5)。

        我的观点

        1. EDN作为嗜酸性粒细胞颗粒释放的一种细胞毒蛋白，它作为一种哮喘诊断和动态监测的生物标志物在多种超敏反应相关疾病中均有一定研究，如毛细支气管炎后儿童反复喘息、儿童哮喘、过敏性鼻炎和气管炎后慢性咳嗽等。现有研究也发现EDN水平与呼吸道感染儿童喘息症状、慢性荨麻疹、慢性鼻窦炎相关，而本文报道研究亦证明了嗜酸性粒细胞是EDN的主要来源，且在健康非吸烟受试者中，无论有无特应性，嗜酸性粒细胞与EDN水平强相关。而嗜酸性粒细胞炎症是过敏性哮喘的主要病理特征，所以研究提出EDN对嗜酸性粒细胞活化的哮喘具有一定的诊断价值，但诊断特异性尚需更多的研究来加以明确。

        2. 近年来关于EDN与哮喘的研究较多，包括血清EDN与哮喘的严重程度，哮喘发作及稳定期的EDN水平等，本文引用研究证明了血清EDN易于获取和存储、易于定量且稳定性很强，近来也有研究表明血清EDN水平比血嗜酸性粒细胞计数更能反映哮喘的控制情况，这表明EDN具有作为哮喘诊断和监测的生物标志物的潜力。但目前的数据尚不足以说明EDN可作为成熟的生物学标记用于评估嗜酸粒细胞性疾病的严重性及药物治疗反应。

        参考文献

        [1]Rutten Bert,Young Simon,Rhedin Magdalena,et al. Eosinophil-derived neurotoxin: A biologically and analytically attractive asthma biomarker.PLoS One 2021;16: e0246627

        [2] Jin An , Ji-Hyang Lee , Ju Hee Sim,et al. Serum Eosinophil-Derived Neurotoxin Better Reflect Asthma Control Status Than Blood Eosinophil Counts.J Allergy Clin Immunol Pract 2020;8(8): 2681-2688