新冠COVID-19的大流行已经持续了一年，全球感染人数超过1亿，针对疫情防控，各种检测方法层出不穷，《Nature Materials》近日发表了UNMC(内布拉斯加大学医学中心)的长综述，本篇综述系统的总结了到目前为止针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的各类诊断方法，详述了血清抗体监测方法及快速检测、基于病毒核酸的RT-PCR法以及LAMP法，并特别关注了采样的方法学、基于纳米材料的FRET发光新型核酸检测法;此外，本文讨论了CT及MRI影像学诊断。

综述摘要

新型冠状病毒SARS-CoV-2已经传播到全球每个角落，影响了社会的稳定性。COVID-19能够引起发烧、喉咙痛、咳嗽、胸部和肌肉疼痛、呼吸困难、思维混乱、嗅觉缺失、衰老和头痛，甚至发展到危及生命的呼吸功能不全，影响心脏、肾脏、肝脏和神经系统。SARS-CoV-2感染的诊断常与流感和季节性上呼吸道病毒感染相混淆。出于治疗策略和防护措施的需要，迫切的需要快速诊断。这篇综述阐述了快速增长的可用和正在开发的诊断测试，并包括基于纳米材料的工具。

热点1 | 样本采集和基于CRISPR的诊断

样本采集

SARS-CoV-2通过呼吸道气溶胶或热原传播。单独或联合采集的鼻或口咽样本可证实病毒感染的存在。SARS-CoV-2在下呼吸道进行复制，支气管肺泡灌洗、气管抽吸物和胸膜液和/或尿液、血液和粪便的样本都可检测到病毒的存在。

唾液是SARS-CoV-2和病毒特异性抗体的替代来源。唾液病毒抗原或抗体测试可能成为未来长途旅行的标准，阳性唾液病毒抗原测试可识别受感染的个体。

规律间隔成簇短回文重复序列 (CRISPR)和相关蛋白(Cas12/13)诊断。

CRISPR–Cas是一个功能强大的系统，广泛用于基因组编辑。Cas酶(Cas12和Cas13)具有切割活性，可用于核酸检测。基于Cas12和Cas12的检测系统由发明人命名为:DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告检测系统(DETECTR)和特定的高灵敏度酶报告分子解锁(SHERLOCK)。使用SHERLOCK可以在一小时内以横向流动的形式读出样品。它通常用于检测细菌、病毒和癌症。

Cas13是一种RNA靶向酶，对来自患者样本的非靶核酸具有混杂的切割活性。当酶识别其目标时，它切割目标核酸，以及溶液中的其他RNA(附属切割)，用于飞沫浓度检测。

Cas13已经与等温预扩增步骤配对。SHERLOCK最初是在2017年开发的，然后经过改进使其适用于概念验证测试(PoC)，并被称为STOPCovid。STOPCovid包含荧光分析和侧向流检测。Sherlock Biosciences的SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2试剂盒已获得紧急使用授权(EUA)，用于检测SARS-CoV-2 。现在，基于SHERLOCK的多路诊断可用于检测160多种感染源。

CRISPR–Cas12a /向导RNA复合物和荧光探针使用标准RT–PCR 或等温重组酶聚合酶扩增来检测目标扩增子，其中引物用用于检测两个RNA拷贝的病毒F1ab和核衣壳区域。基于CRISPR的阳性荧光检测在RT–PCR上可能为阴性。通过与等温扩增(DETECTR)相结合，开发了Cas12对单链DNA的侧链切割活性。Mammoth Biosciences开发了基于DETECTR的COVID-19诊断方法。

一图读懂SARS-CoV-2血清学检测

图1/SARS-CoV-2血清学检测

SARS-CoV-2特异性重组抗原固定在硝酸纤维素膜上，与有色乳胶珠结合的鼠抗人IgM和IgG抗体固定在结合垫上。向测试区域加入样本，如果样本中存在SARS-CoV-2特异性的IgG/IgM便会与有色抗体形成胶乳共轭复合物。这种固定在膜上的复合物被SARS-CoV-2特异性重组抗原捕获，则会出现一个色带，表明检测结果呈阳性。而该复合物被羊抗鼠抗体捕获在膜上，形成红色控制线，没有色带表明结果是无效的。

a–e，(a)将患者血清添加到样品流孔中(S)，滴加盐水缓冲液(b)，并孵育样品(c)，直到抗体-抗原识别(d)和SARS- CoV-2抗体检测(e)。f，胶体金标记的兔抗体在对照(C)孔中显示。

阳性测试带(T)指示存在COVID-19抗体，而没有阳性C带的结果无效。值得注意的是，这种检测描述了免疫后反应，并可能对最近被感染的个体显示阴性结果。它也可以在既往感染但无症状的人身上检测到病毒。

一图读懂RT-PCR检测SARS-CoV-2

a，RT–PCR分析：(i)鼻咽拭子收集患者样本。(ii)样品在2–8℃下储存3天。(iii)从含有SARS-CoV-2感染细胞和游离病毒颗粒的液体中提取RNA。(iv)然后将回收的病毒RNA反转录为cDNA，并扩增以检测病毒核酸。RdRp和E基因的保守区是用荧光探针通过qPCR扩增的亚基因组病毒片段。(v)阳性病例超过检测阈值。

一图读懂RT-LAMP检测SARS-CoV-2

b，SARS-CoV-2 RT-LAMP分析：(i)扩增混合物;(ii)RT-LAMP反应;(iii)SARS-CoV-2 RT-LAMP反应的产物。尽管由于高灵敏度，RT-PCR方法被用作检测SARS-CoV-2的标准，但存在局限性。作为替代方案，开发了等温扩增或LAMP。当针对检测进行优化，测定与标准PCR一样灵敏，每个反应可检测到<10个病毒拷贝。

一图读懂唾液测试检测SARS-CoV-2

c，SARS-CoV-2唾液测试。该图显示了唾液腺中的SARS-CoV-2感染以及在 中积累的释放的特定生物标记。这些通过样品管收集，用特定的生物标记蛋白标记，并通过侧向流快速测试。在SARS-CoV-2感染者中，球结膜注射很常见。

一图读懂基于纳米材料的SARS-CoV-2检测

图3 | 基于纳米材料的SARS-CoV-2检测的代表性插图

顶部：基于场效应晶体管(FET)的检测SARS-CoV-2的生物传感设备。这种传感器是用带有抗SARS-CoV-2特异性抗体的石墨烯片制成的。

底部：基于二维金纳米岛的双功能等离子体光热生物传感器和局域表面等离子体共振生物传感器，通过荧光和基于FRET的核酸杂交功能化用于检测选定SARS-CoV-2序列的cDNA受体，或者使用核酸或抗体功能化纳米材料，通过比色和抗原结合试验进行SARS-CoV-2检测。

Ab，抗体;Ag，抗原;FRET，福斯特共振能量转移;NP，纳米颗粒。

热点2 |快速诊断试剂盒

多家公司正在制造SARS-CoV-2诊断检测试剂盒，旨在提高检测率。例如，GenMark Diagnostics正在开发仅适用于ePlex的研究用途测试，并将很快向US FDA提交EUA的ePlex SARS-CoV-2病毒诊断测试申请。

BioFire Diagnostics正在开发FilmArray呼吸板(RP和RP2)，也称为BioFire呼吸板，这将帮助临床医生快速诊断SARS-CoV-2和其他呼吸道感染。

Meridian Biosciences通过去除RNA提取，创造了一种包含快速测试构建模块的预混合液，从而简化了常规分子程序步骤。这可以显着降低测定成本和时间。

Cepheid也宣布了SARS-CoV-2测试套件，该套件可在全球23,000个GeneXpert系统中的任何一个上运行，以在30分钟内提供PoC结果。

最近，雅培快速抗原检测卡BinaxNOW COVID-19 Ag Card获得了美国FDA EUA，该卡依靠流技术从可疑COVID-19的个体中检测鼻拭子中的SARS-CoV-2抗原，灵敏度为97.1%，特异性为98.5%。该测试仅需15分钟即可提供结果，费用为5美元。雅培还启动了NAVICA应用程序，该应用程序使人们能够以QR码的形式显示从医疗保健提供者处获得的阴性测试结果，从而进入需要测试证明的组织。测试结果呈阳性的人会收到一条隔离消息，并联系医疗保健机构进行治疗。

影像检查建议总结:

影像检查不适用于无症状病毒感染者的新冠肺炎筛查。

除非患者有疾病进展的风险，否则不适用于轻度新冠肺炎病患者。

无论SARS-CoV-2检测结果如何，影像学均适用于中度至重度新冠肺炎病患者。

有呼吸功能不全证据的COVID-19患者应进行成像。

在资源有限的环境中，CT使用受限，进行常规的胸片检查。

附加建议:

COVID-19稳定插管患者不需要每日胸片。

CT适用于功能性肺损伤或低氧血症患者。

在CT扫描中提示病毒感染的患者应进行COVID-19检测。

图4 |对威胁生命的SARS-CoV-2感染的肺和脑进行Ct和MRI检查

a，在代表性的CT扫描中比较未感染者(左)和SARS-CoV-2感染者(右)的肺组织。在这些图像中，由于炎症反应，可以看到毛玻璃样的浑浊(光线模糊的灰色组织)。危及生命的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)导致受影响肺组织中的液体积聚，与心脏功能障碍(非心源性肺水肿)无关。病毒感染导致肺损伤，导致气体交换丧失、肺不张和低氧血症。ARDS与组织性肺炎和肺泡损伤有关。SARS-CoV-2引起上皮感染和肺泡巨噬细胞炎症，并激活和分泌一系列促炎和趋化因子，导致进行性肺组织损伤。

b，SARS-CoV-2感染患者的脑部MRI显示了典型的脑炎或急性坏死性脑病患者的脑区。侧脑室的边缘可以显示脑膜受累的对比增强(红色箭头)。内侧颞叶(黄色箭头)，包括海马体，可能显示高信号，表明炎症可能由“细胞因子风暴综合征”引起，低信号表示出血。包括丘脑、脑白质、脑干和小脑在内的其他脑区也可能参与其中。

热点3 |大规模集中筛选和宏基因组分析

SARS-CoV-2的爆发使全世界的医疗保健系统不堪重负。因此，必须采取可靠的筛查方法，尤其是筛查无症状感染者，以控制疾病传播。为了加快筛查速度，汇集可以为受感染的个体提供监视。

高通量，高度自动化的PCR测试和矩阵汇集策略

如果集中检测为阴性，则所有单个样本均被视为阴性。如果发现一个阳性集，则必须对单个样本进行测试以查明阳性源。如，在第二次世界大战期间，人们用汇集法来检测梅毒，1991年用它来检测人类免疫缺陷病毒。要选择一种具有成本效益的统筹策略，必须考虑任何接受测试的人群中的疾病患病率以及特异性，敏感性和测试可能性。

在一个月没有新确诊病例之后，中国武汉市报告了6例SARS-CoV-2新病例。此后，政府将工作重心转移到广泛筛查上，并集中检测以减轻第二波感染。

集中检测可以使用RT-QPcR测试。美国食品和药物管理局已经根据EUA的规定批准了Quest Diagnostics SARS-CoV-2 RNA和LabCorp的新冠肺炎测试。在世界卫生组织最近的一项研究中，使用蒙特卡洛模拟法对现有方法进行了人口测试。

模拟显示，在患病率低至86%的人群中，需要较少的测试。随着患病率的增加，集中程度减小。在一项对3592份连续鼻拭子样本的单独研究中，患病率不到1%，八样本合并检测具有100%的灵敏度、特异性和准确性，并且成本降低了80%。

此类指南由美国疾病控制与预防中心发布，以汇总样本。在一项回顾性研究中，于2020年1月1日至2月26日之间收集了常规呼吸道病毒检测阴性且未接受SARS-CoV-2检验的住院和门诊患者的支气管肺泡灌洗液和鼻咽样本。收集9或10个样品，并使用RT-PCR对E基因进行筛选。

全部样本中，仅确认了0.07% (2/2，888)的SARS-CoV-2阳性率，主要包括鼻咽样本，这表明在大流行早期该地区的疾病负担较低。

珀金斯默基因组公司与佐治亚医学院(美国佐治亚州奥古斯塔市)和阿加汗大学(肯尼亚内罗毕市)合作的珀金斯默基因组公司开发了一种RT–PCR试剂盒，用于经济有效、快速和准确的SARS-CoV-2大规模筛查，阳性符合率为91.6%，阴性符合率为100%。珀金埃尔默的RT-PCR试剂盒最近获得了美国FDA EUA的批准，其SARS-CoV-2的检出限<20拷贝< span="">/ml-1。

在另一项研究中，观察到在提取核酸过程中合并临床鼻咽或口咽拭子的可行性，并且不会降低RT–PCR的敏感性。当在阳性样本的患病率≤1%的人群中进行测试时，合并可消除多达80%的试剂成本，从而降低全球成本。

需要重新开放的学校，大学，工作场所和宗教组织可以采用这种集中策略。肉类加工厂就采用了合并策略，发现了更高的感染率。不过，用这种方法无法确定感染的绝对数量 。

宏基因组图谱

美国对SARS-CoV-2的检测比中国的早期病毒检测晚了两个月。这导致了RT–qPCR 的实施延迟和病毒快速传播。因此，需要无偏见的检测策略来绕过病毒序列数据诊断感染的需求。宏基因组下一代测序(mNGS)可以检测整个病毒基因组和任何共感染。

使用经RT–PCR证实的病例，并与2019年基因库核苷酸数据库进行比对，利用Clinically Okay Metagenomics Pipeline(CLOMP)，验证了mNGS方法。CLOMP结果显示，与SARS-CoV相关病毒数据库相匹配的SARS-CoV-2阳性样本。无偏倚的mNGS的优点是，它可以检测与已知细菌和病毒数据库一致的所有序列，扩展了只能检测已知的病毒序列的引物导向聚合酶链反应。

同样，也有扩展版本的研究关注宏基因组数据中短的、类似病毒的DNA序列。来自乌兹别克斯坦干燥咸海盆地的宏基因组数据已经确定。根际微生物群刺毛碱蓬(Suaeda acuminata)是环境极端条件下第一批先锋植物的生态特征。

这些研究还揭示了新冠肺炎疫情爆发前冠状病毒样序列的存在。在环境数据集中观察到不同的β冠状病毒样序列，包括SARS-CoV匹配的序列。

此外，这些数据集使得研究不同来源的病毒成为可能。这项研究提出了自然环境和植物根际宿主包含冠状病毒序列的概念。这种涉及微生物研究的宏基因组策略有助于在大流行爆发前预测未来的疫情。

简而言之，宏基因组学是一种可用于分子流行病学测试的敏感检测方法，能够研究病毒进化和分子流行病学，并完成背景微生物群的评估。