支气管哮喘，作为全球最常见的慢性气道疾病之一，严重危害人类健康(1)。其主要病理生理特征是气道高反应、炎症和气道重塑(2)。传统的治疗方案包括抗炎及支气管舒张治疗，但其最大剂量下仍有5%-10%患者症状持续存在，因此深入探讨哮喘发病机制，为其寻找新的治疗方案迫在眉睫。气道高反应作为哮喘主要特征之一，主要由平滑肌收缩所致(3)。

近年来，研究者发现一个新的领域，探索气道上皮与平滑肌之前的联系在气道高反应中作用。传统意义上，气道上皮主要作为生理屏障保护平滑肌免于外界过敏原刺激，以及产生代谢产物如乙酰甲胆碱，调节平滑肌收缩(4)。

近30年，研究者在健康者中发现一个新的产物，该物质能够通过抑制钙离子水平，从而抑制平滑肌收缩，故将其命名为上皮来源的支气管舒张因子(5)。

2018年，全基因组基因中心搜索(Genome-Wide Gene-Centric Search)发现了12个与哮喘相关的表观遗传相互作用的基因，其中出现一个Ca2+调控基因，斯钙素-1(Stanniocalcin-1，STC1)(6)，提示STC1可能在哮喘中发挥一定的生物学功能。STC1是一种钙离子调控蛋白，结合哮喘气道高反应的发病机制与钙离子内流所致平滑肌收缩密切相关。

因此我们猜测：STC1可能与哮喘气道高反应密切相关。

通过一系列预实验结果发现：STC1主要表达在小鼠支气管上皮，且能够抑制小鼠气道高反应。

通过阅读大量文献，发现目前关于上皮细胞与平滑肌细胞之间的相互作用是哮喘气道高反应形成的关键一环，且目前研究甚少。

结合我们的预实验结果，猜测: STC1可能作为一个上皮起源支气管舒张因子(EpDRF)在哮喘气道高反应中发挥作用。

该构思主要由姚欣教授及第一作者许家艳完成。我们通过人体、动物、细胞等多方便展开了初步研究。

本研究的主要发现

(1)哮喘患者血清STC1水平较健康对照组降低，且与哮喘控制水平及肺功能呈正相关

将纳入本研究的116例受试者分为哮喘组(n=93)和健康对照组(n=23)，根据哮喘控制水平将哮喘组再分为3组：完全控制组(n=39)，部分控制组 (n=29)，未控制组(n=25)，采用ELISA检测血清STC1水平，结果显示：与健康对照组相比，哮喘组患者血清STC1水平明显降低(p<0.0001，图a)。根据gina指南哮喘症状控制，将哮喘组分为完全控制组、部分控制组和未控制组。与对照组相比，血清stc1水平在完全控制组、部分控制组和未控制组呈逐渐下降趋势(< span="">P1<0.01< span="">，P2<0.01< span="">，P3<0.001，< span="">图B)，且未控制组STC1水平较完全控制组明显下降。根据哮喘控制测试，血清STC1水平与哮喘控制水平评分呈现明显的正相关(P<0.05，图C)。根据肺功能结果显示，血清STC1水平与肺功能(FEV1、FEV1%预计值及FEV1/FVC)呈现明显的正相关(P1=0.0113，P2=0.0046，P3=0.0437，图D、E、F)，与血清IL-13水平呈现负相关(p=0.0009，图G)。使用ICS/LABA治疗10个哮喘患者1年后，检测STC1治疗前后水平，发现STC1治疗后水平升高，且与哮喘控制水平改善相关(p=0.022，图H)。在哮喘患者血清及痰液中我们发现，STC1与皮质类固醇抵抗指标FKBP5mRNAs均呈负相关(P1=0.0057，P2=0.0027，图I-J)，提示STC1与激素抵抗性哮喘有关。

(2)STC1主要表达在小鼠支气管上皮

免疫组化结果显示：STC1主要表达在支气管上皮细胞，且在哮喘小鼠中表达降低(P<0.0< span="">5，图A-B)。此外，哮喘小鼠肺泡灌洗液中STC1水平较对照组也是降低的(P<0.0< span="">5，图C)。

(3)rhSTC1能抑制OVA诱导的哮喘小鼠气道高反应及平滑肌收缩

为进一步阐明STC1在哮喘中作用，我们采用STC1重组蛋白(rhSTC1)滴鼻处理急性哮喘小鼠(图A)，分为对照组(CON)、哮喘组(OVA)、STC1处理组(OVA+STC1)，结果发现随着乙酰甲胆碱(Mch)浓度上升，鼻内滴注人重组STC1(rhSTC1)在25、50(mg/mL)浓度时可明显抑制急性哮喘小鼠气道高反应(P<0.05< span="">，图B)。同时STC1处理组气道平滑肌收缩标志物α-SMA表达较哮喘组明显下降(P<0.05< span="">，图C)。表明STC1哮喘气道高反应中发挥一定作用。

(4)rhSTC1能抑制炎症细胞浸润及相关因子释放

采用HE染色小鼠切片，发现哮喘组肺泡周围及支气管周围大量炎症细胞浸润(P<0.0< span="">1)，rhSTC1滴鼻能明显抑制上述炎症(P<0.05< span="">，图A-B)。肺泡灌洗液细胞计数结果显示，STC1明显抑制白细胞总数嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及巨噬细胞数目(P<0.05，图c-d< span="">)。哮喘组肺泡灌洗液中IL-13、IL-4、IL-5、MCP-1水平明显升高(P1<0.0< span="">01，P2<0.0< span="">5，P3<0.0< span="">1，P4<0.0< span="">01，图E-H)，外源加入rhSTC1 抑制了IL-13 及MCP-1释放，对IL-4及IL-5 没有此效应(P1<0.0< span="">01，P4<0.0< span="">5，图E-H)。

(5)IL-13下调STC1表达及分泌

体外采用16HBE细胞系研究发现，IL-13能抑制STC1mRNA及蛋白表达，而IL-4 没有此效应(P<0.0< span="">5，图A-B)。相似的结果在人原代支气管上皮中得以验证(图C)。与此同时，我们发现，IL-13处理细胞1h后，STC1 mRNA 水平瞬间升高，随着时间延长，到12-24h，STC1水平明显下降(图D)。而IL-4 没有此效应(图E-F)。ELISA结果显示，IL-13调节STC1分泌具有相同结果(图G)。

(6)rhSTC1通过阻断钙离子内流及肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化抑制了平滑肌收缩。

体外采用胶原收缩实验发现，乙酰甲胆碱(Ach)处理原代平滑肌细胞4h后，明显促进胶原收缩，收缩率达80%。rhSTC1预处理2h后，收缩率达67%，与Ach处理组相比，rhSTC1明显抑制ASM收缩(P1<0.0< span="">01，P2<0.0< span="">1，图A)。我们采用Western Blot研究发现，Ach明显促进MLC磷酸化水平，外源加入rhSTC1可抑制此效应(P1<0.0< span="">1，P2<0.0< span="">5，图B)。同时发现，Ach明显促进ASM细胞钙离子内流，且呈浓度依赖性增加，外源加入rhSTC1明显抑制了此效应(图C)。采用毒胡萝卜素(TG)诱导胞浆内钙离子浓度增加，外源加入rhSTC1可抑制此效应(图D)。PCR结果发现，TG可诱导原代平滑肌细胞SOCE通道蛋白STIM1、Orai1 和TRPC1 mRNAs的表达增加，外源加入rhSTC1抑制了STIM1 的表达(P<0.0< span="">5，图E)，对Orai1和TRPC1表达没有影响(图F-G)。

结论

我们研究首次发现，支气管上皮表达及分泌的STC1，可作为上皮来源的重要支气管舒张因子调节平滑肌收缩，进而抑制哮喘气道高反应发生。同时，血清STC1水平可反应哮喘严重程度。STC1作为一种新型的EpDRF，为哮喘上皮细胞与平滑肌细胞相互作用，以及气道高反应机制的研究提供了新的思路，促进了对哮喘发病机制的进一步认识。

本实验中有以下几个技术难点：

1、哮喘动物实验，因为此前并没有相关文献报道STC1在哮喘小鼠中的研究，因此对STC1作用于哮喘小鼠的浓度，经过反复摸索以及其他肺部疾病动物实验研究参考，最终确定了浓度。

2、原代平滑肌细胞的收缩实验，此实验反复失败，经过严格的时间控制及各个环节的浓度控制，最终观察到了收缩现象并成功完成实验。未来将着重于STC1在哮喘中的机制研究及上皮与平滑肌的直接作用。

本研究从立题、实施、投稿、修回、补实验到最终接受，历经五年时间。在这段时间里，本课题组的各位年轻战友们合作默契，各自承担课题一个方面内容，齐心协力，最终确保了研究的全部完成。

参考文献

1、Bousquet J, Mantzouranis E, Cruz AA, Ait-Khaled N, Baena-Cagnani CE, Bleecker ER, et al. Uniform definition of asthma severity, control, and exacerbations: document presented for the World Health Organization Consultation on Severe Asthma. J Allergy Clin Immunol 2010;126(5):926-38.

2、Barnes PJ. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol 2008;8(3):183-92.

3、Lauzon AM, Martin JG. Airway hyperresponsiveness; smooth muscle as the principal actor. F1000Res 2016;5.

4、Tam A, Wadsworth S, Dorscheid D, Man SF, Sin DD. The airway epithelium: more than just a structural barrier. Ther Adv Respir Dis 2011;5(4):255-73.

5、Vanhoutte PM. Epithelium-derived relaxing factor(s) and bronchial reactivity. Am Rev Respir Dis 1988;138(6 Pt 2):S24-30.

6、Kogan V, Millstein J, London SJ, Ober C, White SR, Naureckas ET, et al. Genetic-Epigenetic Interactions in Asthma Revealed by a Genome-Wide Gene-Centric Search. Hum Hered 2018;83(3): 130-152.