近期，西安交通大学医学院第一附属医院焦自钊等研究了构建慢病毒-VEGF165载体及其转染脂肪干细胞后表达的研究，研究发现，经RT-PCR法克隆目的基因,成功构建了表达VEGF165基因的慢病毒载体,转染ADSCs后可在体内、外稳定表达VEGF165。该文章发表于2016年03期《中国药学杂志》上。

该研究旨在应用反转录-聚合酶链反应技术克隆目的基因,构建慢病毒-血管内皮生长因子165(VEGF165)载体,转染脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue derived stem cells,ADSCs),并验证VEGF165蛋白的体内、外表达。

研究者们选取应用RT-PCR技术克隆目的基因VEGF165片段,并克隆于慢病毒骨架质粒p LVX-EF1α-IRES2-Ac GFP1中,构建慢病毒载体p LVX-EF1α-VEGF165-IRES2-Ac GFP1,菌落PCR及测序分析加以鉴定。慢病毒载体主体质粒p LVX-EF1α-VEGF165-IRES2-Ac GFP1,辅助质粒gag-pro、vpr-pol、Tet-Off、tat-IRES-rev和包膜质粒env(VSV-G)共转染Lenti-X 293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。胶原酶消化法分离、培养ADSCs,形态学、免疫荧光及多向分化鉴定。包装后的慢病毒载体转染ADSCs,免疫荧光、ELISA鉴定VEGF165在ADSCs中的体外表达。转染VEGF165的ADSCs体内注射,ELISA鉴定VEGF165的体内表达。

结果显示，成功克隆了目的基因VEGF165片段,构建的慢病毒载体p LVX-EF1α-VEGF165-IRES2-Ac GFP1经菌落PCR鉴定存在目的基因VEGF165片段,测序分析证实与Genbank报道的VEGF165基因序列完全一致。六质粒共转染Lenti-X 293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。包装后慢病毒测定滴度为1×108TU·m L-1。培养的ADSCs经形态学、免疫荧光及多向分化鉴定,符合文献报道的ADSCs特点。慢病毒载体转染ADSCs后经免疫荧光验证约90%ADSCs可表达VEGF165,同时ELISA也证明VEGF165在体内、外稳定高效表达。