新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotising enterocolitis，NEC)是新生儿期常见的严重胃肠道急症，起病急、进展快、病死率高。多见于早产儿和低出生体重儿，临床上多以呕吐、腹胀、腹泻、便血和喂养不耐受为主要症状，严重者可发生肠管坏死、穿孔和弥散性血管内凝血(DIC)。关于国内外有关NEC流行病学报道各国差异较大，国外NEC在活产婴儿发病率为 0.1%～0.3%，占新生儿危重监护室(NICU)住院患儿的2%～5%。85% NEC患儿为早产儿[1]，晚期早产儿和足月儿仅占7%～15%[2]。 极低出生体重(VLBW)NEC发生率约7% [3]，发病率与胎龄成负相关，研究表明，22～28周早产儿发病率最高(11%)[4]，在瑞典和加拿大报道NEC发病率则较低[5-6]。目前，专家们意识到，早期识别和预防对其预后起到积极作用。目前，NEC仍是新生儿院内病死率高的重要原因之一，对于超低出生体重(ELBW)需要外科手术治疗的患儿病死率则高达40%～45%[7]。中国2011年全国新生儿学组调查结果显示，VLBW早产儿NEC发生率为6.6%，早产儿一旦发生NEC，病死率高达20%～30%。尽管认为早产、感染、小肠功能不成熟、全身和黏膜免疫反应不成熟、配方奶喂养，以及肠道缺氧-再灌注损伤是NEC的高危因素，但对其病因和发病机制了解仍非常有限，传统治疗如禁食、静脉营养、应用抗生素、胃肠减压及外科手术治疗等防治措施疗效欠佳，人们试图探索新的有效措施预防NEC。近年来，许多报道显示，肠道菌群失衡是NEC发生的重要和基础原因，故减少NEC损害的关键是预防，其中微生态制剂的应用是目前研究的热点， 但绝大多数是基于动物实验研究， 临床应用文献报道不多。本文就益生菌制剂防治NEC的机制研究、 临床疗效以及安全性等方面进行阐述。

1 新生儿肠道微生物群初始化定植及影响因素

新生儿出生后肠道微生物群的定植是一个连续而复杂的过程。以往研究认为“胎儿肠道是无菌的”，目前越来越多研究报道，在母孕期胎盘、脐血管和羊膜腔中分离出微生物DNA，表明胎儿在宫腔内就开始接触微生物菌落，存在“母亲-胎儿通路”，这取决于母孕期肠道菌群的变化。Jost等[8]取7对母婴粪便及乳汁样本采用焦磷酸全基因测序发现，3种样本的短双歧杆菌是同源的，梭菌属在母亲粪便和母乳样本是同源的，证实肠黏膜相关厌氧菌可通过母乳垂直传播，由母亲肠道传递到婴儿肠道：(1)母孕期内分泌变化增加了母亲肠道通透性，有利细菌移位;(2)乳房皮肤菌群和婴儿 菌群逆行进入乳房帮助建立乳汁菌群;(3) 母亲肠道菌群被免疫细胞选择性摄入，携带移位至乳腺，进入婴儿肠道。众多研究表明，分娩方式是影响肠道微生物群初始化定植的重要因素，阴道分娩儿出生时接触母亲羊水、阴道、会阴区，及母亲粪便微生物群，其菌群主要由乳酸杆菌、普氏菌和双歧杆菌构成;剖宫产儿出生时所接触的环境主要为周围“无菌”环境、医护人员消毒的手，以及母亲皮肤， 构成以葡萄球菌为主的菌群结构， 而乳酸杆菌、双歧杆菌和拟杆菌定植延迟。出生后喂养方式是影响肠道微生物群演替的重要因素。研究显示，与人工喂养儿相比，母乳喂养儿生后1周内肠道有大量双歧杆菌、肠球菌和肠杆菌定植，1个月后双歧杆菌为绝对优势菌，母乳喂养儿肠道双歧杆菌数量明显高于人工喂养儿，其原因是母乳中存在双歧杆菌，其中的低聚寡糖可促进双岐杆菌生长。而人工喂养儿肠道中双歧杆菌数量少，并呈现多样性改变。早产儿和低出生体重儿由于肠神经系统发育和胃肠发育不成熟，胃肠液分泌相对少，胃肠蠕动弱，规律性差，易造成细菌移位致小肠细菌过度生长。另外，早产儿肠道内医院环境菌的定植干扰正常菌群定植，致使共生菌定植延迟，种类单一，多样性降低，这一特点易导致肠道耐药菌种出现，细菌过度增长或移位，从而诱发肠道炎症，发生NEC。近些年来，对早产儿肠道微生物群分析发现，NEC患儿生后早期即存在异常的初始化菌群定植模式，尤其在NEC发生之前，肠道菌群结构已发生质和量的变化，包括菌种数目减少和致病微生物的出现，可检测到克雷伯杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、艰难梭菌和表皮葡萄球菌等。

2 NEC与肠道菌群

益生菌制剂是近年来研究热点，许多研究显示，益生菌能促进肠相关免疫功能的发育和成熟，生成有机酸，降低肠内pH值，产生天然抗生素，与致病菌竞争黏附部位，抑制致病菌生长，并促进肠黏膜上皮细胞的分化成熟。故国内外学者力图将益生菌制剂用于NEC的防治，以期降低NEC的患病率和病死率。

以往研究认为，早产、感染、全身及黏膜免疫发育不成熟、配方奶喂养、肠黏膜缺血-氧合不足是引发NEC的重要因素。(1)早产儿肠道发育不成熟、肠黏膜屏障功能及黏膜免疫功能不成熟、炎症易感性高，易患NEC。(2)肠腔液体流动是从绒毛血管到肠腔，易导致肠黏膜缺血，如喂哺高渗性配方奶或其他高渗性液体易导致肠黏膜受损[9]。但最近Meta分析显示，过早或延迟肠道内喂养并不影响NEC发生风险[10]。(3)反复发作的呼吸暂停、呼吸窘迫、辅助通气及脐血管插管使早产儿缺氧，也是导致NEC发生的重要因素。(4)合并感染如败血症或其他部位感染时，肠内病原菌过度繁殖，以及微生物毒素对肠黏膜造成直接损伤。感染对NEC的作用是因还是果，目前尚不清楚。故上述众多因素通过影响肠黏膜血供和肠黏膜屏障功能，导致肠蠕动减弱，食物积聚肠腔影响肠功能导致细菌在肠腔和肠壁繁殖，大量产生，引起肠壁损伤，甚至坏死、穿孔和全身性炎性反应、休克、多器官衰竭。

早产儿肠道共生菌失衡表现为肠道某些正常菌种定植缺少或出现异常菌种定植，这种异常的定植模式被视为是NEC发生过程中关键危险因素[11]。随着人类微生物基因组学计划的建立和实施，从基因水平上发现了之前难以培养的肠道微生物种，为NEC发病机制中病原菌定植假设提供证据。肠道是与外界环境接触面积最大的器官，也是人体最大的免疫器官，肠道微生物群、肠黏膜屏障和黏膜免疫三者达成平衡，才能维系肠道和机体的健康，任何因素破坏了这一平衡，会使肠道从健康的稳态转变到不受控制的炎性反应状态，引发肠黏膜损伤，这也是潜在导致NEC发展的基础。早产儿出生后不成熟的肠腔需要从环境中获得有益共生微生物群，帮助建立平衡的微生态体系，利于早产儿健康发育。母乳喂养实现了这一举措，为新生儿肠道提供了有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等，一些阻止或延迟肠道共生菌获取、定植，引发新生儿肠道微生物群异常初始定植的因素，如长期应用抗生素等，可致共生菌减少，影响肠道黏膜免疫的发育和成熟，增加耐药菌定植，从而增加NEC发生风险。研究表明，生后不久接受抗生素治疗的新生儿肠道双歧杆菌总量较少;延长经验性抗生素治疗，可增加NEC及晚发性败血症的可能[12]。Rakoff-Nahoum等[13]研究发现，广谱抗生素清除肠道菌群导致肠管损伤，同时诱导修复能力降低。生后应用抑酸制剂如雷尼替丁也可增加NEC发生风险，使粪便微生物多样性降低，厚壁菌门如乳酸菌减少，而肠杆菌科细菌比例增加。剖宫产早产儿因失去从母亲产道获得母源性菌群机会，导致共生菌如双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌定植延迟。母乳中的益生原可促进共生菌生长，早产儿因缺乏母乳喂养，就缺乏了促进共生菌定植及生长的时机。与足月新生儿比较，早产儿肠道初始定植优势菌多为革兰阴性杆菌，微生物多样性较低，潜在优势菌多为肠球菌、大肠埃希菌、链球菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌，易发生NEC。Mai等[14]通过对NEC早产儿发病前后大便微生物群测定发现，微生物多样性偏低，变形菌门较多，尤其是抗生素治疗疗程较长时更为显著。Greenwood等[15]临床研究发现，NEC患儿发病前肠道酪酸产气荚膜杆菌、厚壁菌门、变形菌门和阴沟肠杆菌流行，肠道菌群多样性较低。Kuppala等[12]对流行病学资料分析结果也支持该发现。故肠道发育不成熟、炎性反应和异常的肠道微生物定植模式，目前被认为是NEC发病机制中的重要因素。

3 益生菌在NEC中的临床应用

3.1　益生菌防治NEC机制　益生菌防治NEC机制目前尚不十分清楚，基于大量临床和实验研究，认为与以下方面有关：(1)益生菌通过增加黏液分泌、增强肠上皮细胞紧密连接，降低黏膜通透性，增强黏膜屏障完整性，抑制肠道细菌移位。Khailova等[16]在NEC小鼠模型中证实，双歧杆菌可使回肠上皮细胞紧密连接蛋白和黏着连接蛋白表达正常化。Liu等[17]在猪模型中发现，罗伊乳杆菌P43-HUV可通过产生热休克蛋白27和72维持肠道屏障完整性，调节紧密连接蛋白从而抵御产肠毒素性大肠杆菌侵入。生命早期提供益生菌，通过调节肠道微生态多样性与致病菌竞争肠上皮细胞结合位点，分泌抗菌肽和细菌素有效抑制致病菌生长[18]，促进有益菌群定植。(2)益生菌可调节回肠T细胞数量，促进肠道黏膜分泌免疫球蛋白A。目前研究发现，Toll 样受体4(TLR4)信号与NEC发病存在关联，适当释放TLR4信号对肠道免疫反应及肠发育有益，而过度TLR4信号激活会引起肠道严重炎性反应导致NEC[19]。研究发现，乳酸杆菌菌株DSM17938和ATCC PTA 4659在NEC大鼠模型中可降低TLR4和转录因子(NF-κB)表达，下调炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6) 和白介素-1β(IL-1β)表达;鼠李糖乳杆菌能降低胎儿肠道中TNF-α mRNA表达，调节肠黏膜上皮细胞固有免疫Toll 样受体相关基因表达[20-21]。吴文燊等[22]发现，双歧杆菌可下调新生NEC模型大鼠肠道组织TLR4m RNA表达及上调 TOLLIP和SIGIRR mRNA表达，减少炎症损伤，保护肠道组织。(3)目前已有很多益生菌防治细菌感染的研究报道，胚芽乳杆菌在宿主肠黏膜中培养能发挥抑制致病性大肠埃希菌引起的中性粒细胞经上皮的迁移功能。Hsueh等[23]在探讨双歧杆菌减低大鼠模型NEC发病率机制时发现，减少内毒素是减少NEC发生的机制。总之，益生菌可促进肠道微生态菌群多样化，协助建立正常的共生菌群，通过上述机制抑制致病菌的过度增殖，阻止潜在病原菌的侵袭，减少NEC发生风险。

3.2　益生菌防治NEC的有效性　鉴于NEC发病前肠道菌群已发生变化，益生菌可调整或可能使早产儿肠道不正常的菌群定植模式正常化，因此，益生菌对于NEC有潜在的防治作用。Hoyos等[24]首先报道了一项队列研究显示，益生菌可降低NEC发生率。此后，关于益生菌与NEC的相关研究大部分支持益生菌降低早产儿NEC发病率、病死率的结论。

Alfaleh等[25]分析9项随机对照试验(RCT)(1425例早产儿)发现，肠内补充益生菌能降低严重NEC(Ⅱ期或更严重)发生率(RR=0.32，95%CI：0.17～0.60)及病死率(RR=0.43，95% CI：0.25～0.75)。Christine等[26]分析20项RCT研究(5982例VLBW早产儿)，应用益生菌混合制剂(乳酸菌、双歧杆菌、布拉酵母菌)组NEC发生风险明显降低 (RR=0.509，95%CI： 0.385～0.672)。3项ELBW早产儿(771例)RCT研究显示，益生菌并不能显著降低NEC发生风险 (RR=0.712，95% CI：0.390～1.299);但能降低NEC病死率(112/2229 vs. 161/2221)。Dilli等[27]对NICU中400例VLBW早产儿RCT研究发现，益生菌组NEC发生率明显低于对照组，缩短了达到完全肠外喂养的时间，败血症发生率低，缩短住院时间，降低病死率。PiPS多中心RCT研究对1315例早产儿预防性应用短双歧杆菌(B. breve)BBG-001，结果NEC发生率、败血症发生率、病死率与对照组比较差异无统计学意义，认为没有证据表明B. breve BBG-001能预防NEC[28]。

3.3　益生菌适用的NEC人群　在VLBW和ELBW早产儿发生NEC风险最大，尤其是ELBW早产儿，大部分研究支持VLBW早产儿应用益生菌预防NEC， 对于VLBW早产儿应用益生菌之前， 需做风险-效益评估， 对合并短肠综合征、 先天性心脏病、 胃肠道异常、 胃肠道手术、 NEC后期新生儿， 益生菌应用可能是有害的 [29]。仅 2篇 ELBW 早产儿 RCT 研究显示， 应用益生菌不能降低ELBW早产儿NEC发生风险[30-31]，这仍需进一步多中心大样本RCT研究。

3.4　益生菌制剂的选择　益生菌的菌种、菌株及应用方式影响益生菌预防NEC疗效，临床上益生菌应用种类繁多，目前推荐菌株主要为鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌和布拉酵母菌等[32]。Arianna等[33]发表的荟萃分析显示，含有混合成分的益生菌比单一菌株更明显降低NEC发生率(RR=0.39，95% CI：0.27～0.56)， 其中常用混合益生菌制剂， 包括嗜酸乳杆菌和双歧双叉杆菌，可降低NEC发生风险 。预防NEC所需要的益生菌菌株仍需进一步临床研究。

3.5　益生菌制剂临床应用剂量和疗程　开始应用益生菌的时间和疗程报道各异，有在生后24 h内、生后第3天、生后第1次喂养时或第1周喂养耐受时，虽然没有有力证据明确益生菌的开始喂哺时间，口服益生菌还是应在患儿腹部检查正常或临床可以肠道内喂养时开始。益生菌疗程从2周到4～6周， 或直至出院， 益生菌预防NEC文献报道比较支持4～6周直至矫正胎龄36周或直至新生儿出院。使用剂量因各研究使用单位差距较大， 故目前尚未确定合适的益生菌使用剂量， 益生菌预防NEC指南中建议(0.056～6)×107～ 109 CFU/d[3]，仍须进一步大样本研究。

3.6　益生菌应用安全性　一些研究报道了使用益生菌可引起真菌血症、细菌血症、脓毒症[34-35]，但应用的患儿均出现消化系统并发症，分析原因是肠道黏膜屏障破坏后易发生细菌移位，穿过肠壁入血进而发生菌血症，进一步加重肠道黏膜损伤及系统炎症。目前没有患儿因服用益生菌引起远期不良反应报道。有研究将免疫功能低下或缺陷或有短肠综合征患儿列为应用高危人群[36]。Hempel等[37]研究认为，益生菌没有增加总体不良反应风险。Chou等[38]对20对曾经使用与未使用过益生菌患儿随访至3岁时发现，两组婴儿在体格生长(头围、身长、体重)、听力及视觉障碍、认知及运动发育以及脑瘫等差异无统计学意义。Sari等[39] 随访至校正日龄18～22个月时发现，VLBW患儿预防性使用益生菌组与未使用组相比，神经发育及体格生长差异无统计学意义。目前其安全性仍存在争议，仍需更多大样本RCT来说明其安全性和有效性[40]。

大量研究表明，应用益生菌可降低早产儿NEC发生风险[41]，但目前尚无确切证据表明，临床症状改善与益生菌改善微生态菌群结构存在直接联系。肠道微生态菌群是复杂的，不能单纯把益生菌视为药物对待，正如Meta分析或RCT研究中所描述，益生菌对于构建正常肠道菌群结构是有益的，但仍需多中心、大样本RCT研究证实，仍存在许多问题有待进一步解决，如应用菌株特异性、应用时间与临床疗效的关系、应用适宜人群和高危人群等。本文目的是提供给读者近些年来有关NEC病理机制研究的新进展，包括肠道菌群在NEC发生发展中的作用及地位，益生菌制剂在预防和治疗NEC的有效性和安全性，为今后探讨预防NEC策略奠定基础。