据估计，美国每年大约有 1500 万新发生的骨折患者，主要是由车祸、运动伤害或工作事故引起。相当一部分的患者(10-15%)会发生延迟愈合或不愈合，这需要延长治疗或重复治疗，对治疗成本和生活质量都有很大影响。骨折的修复是一个复杂的过程，需要利用内源性的细胞再生潜力来恢复原始的骨骼结构。

        间充质干细胞(MSC)的移植已经在一些疾病模型中显示出治疗效果，包括在稳定的骨折模型中促进成骨和血管生成。不过，将 MSC 直接移植到目标组织，仍然存在局限和挑战。比如，在缺血组织中，移植的干细胞存活率极低。此外，其他相关风险也限制了移植 MSC 在临床上帮助骨折愈合，包括免疫排斥、细胞去分化和肿瘤形成。最近的研究表明，旁分泌机制可能参与了 MSC 在治疗多种疾病中的作用，而外泌体(exosomes)可能在此过程中发挥重要作用。

        研究已经证实，外泌体移植表现出的治疗效果与直接移植的干细胞相似，但不良反应要少得多。之前的一项研究表明，在心肌梗死模型中，MSC 来源的外泌体可促进血管生成。此外，MSC 的低氧预处理可以明显增加其生物学功能和活性，从而提高 MSC 在各种疾病模型中的移植效力。不过，目前还不清楚低氧条件下的 MSC 是否能促进骨折愈合，以及这种增强是否通过外泌体信号传导来介导。

        南京医科大学第一附属医院的研究人员在《Acta Biomaterialia》杂志上发表文章，揭示了低氧条件下间充质干细胞来源的外泌体通过转移 miR-126 而促进骨折愈合。这些结果表明，低氧预处理可作为一种有效的方法，来优化 MSC 来源的外泌体对骨折愈合的治疗作用。

        低氧促进外泌体的释放

        研究人员从人类脐带中分离出人脐带间充质干细胞(HucMSC)，并分别利用 Alizarin Red、Oil Red O 和 Alcian Blue 来鉴定 HucMSC 的成骨、成脂和软骨分化。在此过程中，他们使用了赛业生物的 OriCell™ 成骨、成脂和软骨分化培养基。

        接下来，他们确定 HucMSC 的低氧状况是否会影响它们释放的外泌体。他们在常氧和低氧(1% CO2)下分别接种 HucMSC，孵育 48 小时后从无血清培养基中分离外泌体，并利用电镜、纳米颗粒追踪分析(NTA)和 western blot 进行分析。与常氧对照相比，低氧条件诱导了外泌体释放的显著增加。后续实验还表明，低氧条件下产生的外泌体更容易被内皮细胞 HUVEC 吸收。

        Hypo-Exo 促进血管生成、增殖和迁移

        接着，利用小鼠股骨骨折模型，研究人员评估了 Hypo-Exo 和 Exo 对骨折愈合的作用。他们利用高分辨率 micro-CT 扫描后发现，Hypo-Exo 的移植可促进骨折愈合。为了进一步确定骨折愈合的原因，他们检测了成骨相关基因(ALP、COLA1 和 OCN)和血管生成相关基因(VEGF)。结果表明，Hypo-Exo 主要通过血管生成而促进骨折愈合。

        为了确定 Hypo-Exo 在体外是否发挥相似的治疗作用，研究人员利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)开展体外实验。细胞增殖分析表明，与 Hypo-Exo 共同孵育导致 HUVEC 的增殖显著增加。同时，细胞迁移分析也表明 Hypo-Exo 增强了血管形成能力。这些结果表明，与体外的 PBS 和 Exo 处理相比，Hypo-Exo 可大大促进增殖、迁移和血管形成(图 1)。

        之后，研究人员通过实验证实，来自 Hypo-Exo 中的 miRNA 可能发挥生物学作用，并最终促进骨折愈合。具体是哪个或哪些 miRNA?他们开展了 miRNA 芯片分析，发现 Hypo-Exo 组中有 94 个 miRNA 上调，39 个下调。其中，miR-126 的表达明显上调，且已知其对血管生成具有积极作用。于是，他们后续的研究重点放在 miR-126 上。

        研究人员想了解 miR-126 是否充当了低氧 MSC 与 HUVEC 之间的生物学信使，并可以调节血管生成。通过一系列体外和体内的功能获得和功能丧失分析，他们发现外泌体 miR-126 的 knockdown 能够在体外和体内抑制内皮细胞的增殖，表明 miR-126 在 Hypo-Exo 介导的血管生成中发挥重要功能。通过进一步的分析，他们确认 SPRED1 是 miR-126 的目标基因。

        之前的研究表明，低氧诱导因子 - 1(HIF-1α)对于低氧期间 miRNA 的表达至关重要。因此，研究人员想了解 HIF-1α是否调节外泌体中的 miR-126。通过转染 siRNA，他们发现 HIF-1α的下调显著降低了低氧诱导的 miR-126 表达。后续的分析表明，HIF-1α诱导了 miR-126 的表达及其在外泌体中的负荷。