研究目的

　　1．通过转染SiRNA，探讨抑制SAA对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响；

　　2．探讨SAA与整合素αvβ3间的相互联系；

　　3．通过体内实验明确SAA对骨肉瘤的影响及其相关信号通路。

　　研究方法：

　　1. 细胞培养，SiRNA转染

　　体外培养人骨肉瘤细胞，用转染试剂Lipofectamine 2000转染FPRL-1siRNA，使细胞内FPRL-1受体低表达或抑制，48小时候后收集细胞，以备western检测和real-time PCR检测。

　　2．Western blot检测

　　收集细胞，提取蛋白，用特异性抗体检测SAA、αvβ3、p-p38、ERK1/2、JNK的表达，并用Photoshop软件进行条带灰度分析。

　　3．实时定量PCR (real-time PCR)检测

　　收集细胞后，Trizol法提取总RNA，用TaqMan microRNA反转录试剂盒反转录后以18S为内参检测SAA1的表达，以确定SAA1高表达慢病毒的转染效果。

　　4. 刮伤愈合实验及Transwell实验进行细胞实验

　　5.统计学分析应用软件SPSS 13.0。连续变量分析以均数±标准差表示。组间差异采用方差分析。P < 0.05被认为有统计学差异。

　　研究结果

　　1. SAA对骨肉瘤（U2OS）细胞的迁移与侵袭的影响

　　伤口愈合实验中， SAA组细胞划痕明显小于对照组，表明SAA可诱导U2OS细胞的迁移。Transwell实验中，SAA组细胞计数多于对照组(P<0.05)，表明SAA可促进U2OS细胞的侵袭。

　　2. SAA在mRNA和蛋白水平对αvβ3表达的影响

　　Western blot结果显示及real-time PCR检测结果显示，SAA诱导αvβ3的生成在蛋白和mRNA水平均呈现浓度和时间依赖性。

　　3. αvβ3抑制剂LM609对SAA诱导的细胞迁移和侵袭的影响

　　迁移实验结果显示，αvβ3的表达在对照组、LM609组及LM609+SAA组中均无明显差异（p<0.05），表明LM609可明显抑制SAA诱导的U2OS细胞迁移，αvβ3在SAA诱导的U2OS细胞迁移和侵袭中起到不可或缺的作用。

　　4. ERK1/2 信号通路介导SAA诱导的αvβ3 的表达

　　分别用JNK、p38和ERK信号通路特的异性抑制剂SP600125、SB203580和PD98059预处理U2OS细胞后，Western blot结果显示仅PD98059(ERK1/2特异性抑制剂)能够明显抑制SAA诱导的αvβ3表达。以上结果表明，MAPK家族三个成员均可被SAA激活，但仅ERK1/2信号通路参与U2OS细胞的反应。

　　5. FPRL-1参与SAA诱导αvβ3的生成

　　用FPRL-1 siRNA预处理U2OS细胞后进行real-time PCR和western blot检测，结果显示FPRL-1 siRNA可在蛋白和mRNA水平有效下调FPRL-1水平（p<0.05）。百日咳毒素和WRW4也用于处理U2OS细胞，结果显示αvβ3表达水平下降（p<0.05）。结果表明上述三种试剂均可抑制SAA诱导αvβ3的表达，这进一步表明FPRL-1参与了SAA诱导αvβ3的表达。

　　结论

　　1. SAA通过整合素αvβ3促进U2OS细胞的迁移和侵袭；

　　2. SAA诱导αvβ3的表达呈浓度和时间依赖性；

　　3. SAA通过 FPRL-1/ERK1/2 信号通路诱导αvβ3的表达。