SiRNA真核表达载体阻断小鼠RAW264.7细胞TNF-ɑ基因表达研究
目的: 构建小鼠TNF-ɑ基因的siRNA真核表达载体，探讨其对RAW264.7细胞中TNF-ɑ基因表达的干涉作用。 方法: 。根据GenBank中TNF-a基因的序列及siRNA设计原则，在编码区内选择两段21nt (分别位于基因序列中: 310-330; 718-738)作为不同的干涉区域，分别进行BLAST分析。 根据RNA 干涉载体PSilencer4.1-CMV neo的要
目的: 构建小鼠TNF-ɑ基因的siRNA真核表达载体，探讨其对RAW264.7细胞中TNF-ɑ基因表达的干涉作用。
方法:。根据GenBank中TNF-a基因的序列及siRNA设计原则，在编码区内选择两段21nt (分别位于基因序列中: 310-330; 718-738)作为不同的干涉区域，分别进行BLAST分析。 根据RNA 干涉载体PSilencer4.1-CMV neo的要求分别于上、下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。 每段各设计一对59个碱基的序列，由奥科生物技术有限公司合成。将合成的siRNA 寡核苷酸链退火形成双链，连接入pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体，酶切及测序鉴定。电转染法转染重组质粒入RAW264.7细胞，G418筛选后RT-PCR检测其对TNF-ɑ基因mRNA的干涉效果。
结果: 经酶切及测序鉴定，成功构建siRNA真核表达载体。经电转染法转染RAW264.7细胞后，RT-PCR显示所构建的干涉TNF-ɑ基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达，RAW264.7细胞中TNF-ɑ基因的mRNA表达水平明显降低。
结论: 成功构建了小鼠TNF-ɑ基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer-T1和pSilencer-T2，并在RAW264.7细胞中有效地发挥了对TNF-ɑ基因表达的干涉作用。
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