目的:探讨生理浓度糖皮质激素是否通过激活自噬减少机械损伤脊髓神经元细胞的凋亡。 方法:原代培养胎鼠脊髓神经元细胞,实验分为正常神经元组、神经元损伤组、神经元损伤+激素组。NSE和TUBB3、DAPI免疫荧光双标鉴定脊髓神经元;建立机械损伤模型;流式细胞术检测脊髓神经元的凋亡率;Western Blot检测自噬LC3及凋亡相关蛋白(Caspase-3)的表达水平;QRT-PCR检测LC
目的:探讨生理浓度糖皮质激素是否通过激活自噬减少机械损伤脊髓神经元细胞的凋亡。
方法:原代培养胎鼠脊髓神经元细胞,实验分为正常神经元组、神经元损伤组、神经元损伤+激素组。NSE和TUBB3、DAPI免疫荧光双标鉴定脊髓神经元;建立机械损伤模型;流式细胞术检测脊髓神经元的凋亡率;Western Blot检测自噬LC3及凋亡相关蛋白(Caspase-3)的表达水平;QRT-PCR检测LC3Ⅱ和Caspase-3的mRNA水平;构建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重组质粒,慢病毒转染,采用荧光显微镜观察荧光斑点;透射电镜、AO、MDC荧光染色,评估自噬情况。
结果: ⑴脊髓神经元鉴定:NSE、TUBB3、DAPI三者均阳性所占比例高;⑵流式:损伤各组凋亡水平明显高于正常组,激素组的凋亡水平明显低于损伤对照组(p<0.05);⑶western blot:正常组LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显低于损伤各组(p<0.05);激素组LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显高于损伤组(p<0.05);正常组的Caspase-3表达水平低于损伤各组,激素组Caspase-3表达水平明显低于损伤对照组(p<0.05);⑷QPCR: 正常组LC3Ⅱ的mRNA水平明显低于损伤各组,激素组LC3Ⅱ的mRNA水平明显高于损伤对照组(p<0.05);正常组Caspase-3的mRNA水平明显低于损伤各组,激素组Caspase-3的mRNA水平明显低于损伤对照组(p<0.05); ⑸AO、MDC:正常组的细胞内酸性自噬泡的数量明显少于损伤各组;激素组细胞内酸性自噬泡的数量明显多于损伤对照组(p<0.05);⑹GFP-LC3:正常组细胞内见绿色荧光均匀分布,损伤各组细胞内可见绿色荧光斑点聚集;激素组明显可见细胞内绿色荧光斑点聚集(p<0.05);⑺透射电镜:正常组细胞内很少观察到自噬体,损伤各组皆可观察到明显的双层膜自噬体;激素组可观察到细胞内明显的双层膜自噬体结构且数量较损伤对照组多(p<0.05)。
结论:机械损伤诱导脊髓神经元发生自噬现象;生理浓度糖皮质激素对于受损的脊髓神经元起到保护作用通过诱导激活自噬减少凋亡的发生。
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