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骨科

不同浓度糖皮质激素对机械损伤脊髓神经元细胞自噬与凋亡的影响及作用机制研究

作者:刘文革,王振宇 来源: 2015COA论文汇编 日期:2015-12-20
导读

   目的:研究不同浓度的糖皮质激素对受损脊髓神经元细胞自噬与凋亡的影响。    方法:原代培养胎鼠脊髓神经元细胞;建立损伤模型;分别给予不同浓度的激素干预(10-5M、10-6M、10-7M);MTT检测细胞活力;流式细胞术检测神经元的凋亡率;蛋白免疫印迹、QPCR检测自噬及凋亡相关相关指标;构建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重组质粒,慢病毒转染,荧光显微镜观察;透射电镜、AO、MD

目的:研究不同浓度的糖皮质激素对受损脊髓神经元细胞自噬凋亡的影响。

方法:原代培养胎鼠脊髓神经元细胞;建立损伤模型;分别给予不同浓度的激素干预(10-5M、10-6M、10-7M);MTT检测细胞活力;流式细胞术检测神经元的凋亡率;蛋白免疫印迹、QPCR检测自噬及凋亡相关相关指标;构建pcDNA-3.1(+)-GFP-LC3重组质粒,慢病毒转染,荧光显微镜观察;透射电镜、AO、MDC荧光染色监测自噬情况。

结果:脊髓神经元鉴定:NSE、TUBB3、DAPI三者均阳性所占比例高;MTT:低、中浓度激素组细胞活力较损伤对照组明显增高,而高浓度激素组细胞的活力却明显下降(p<0.05);流式:各浓度激素组的凋亡水平明显低于损伤对照组(p<0.05),高浓度激素组的凋亡率最高,低、中浓度激素组间无明显差异(p﹥0.05);WB:高浓度激素组LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显低于低、中浓度组,低浓度组的自噬水平最高(p<0.05);各浓度激素组的Caspase-3表达水平明显低于损伤对照组(p<0.05),中浓度激素组表达水平最高,低、高浓度激素组间无明显差异(p﹥0.05);QPCR:高浓度激素组LC3Ⅱ的mRNA水平低于低、中浓度组,低浓度组的自噬水平最高(p<0.05);各浓度激素组Caspase-3的mRNA水平明显低于损伤对照组,中浓度激素组最高,低、高浓度激素组间无明显差异(p﹥0.05);AO、MDC:高浓度激素组细胞内酸性自噬泡的数量明显少于低、中浓度激素组,低浓度组细胞内酸性自噬泡的数量最多(p<0.05);GFP-LC3:低、中浓度激素组明显可见细胞内绿色荧光斑点聚集,低浓度组尤明显;高浓度激素组未见明显的绿色荧光斑点聚集(p<0.05);透射电镜:损伤各组皆可观察到明显的双层膜自噬体结构;随着激素浓度的降低,自噬体数量呈增多趋势(p<0.05)。

结论:低浓度糖皮质激素激活自噬减少脊髓神经元凋亡;高浓度激素抑制自噬,然而,神经元的凋亡水平未见增高反而降低,其机制可能是通过抑制炎症反应、脂质过氧化等其他途径来减少脊髓神经元细胞的凋亡;鉴于大剂量应用激素带来的诸多副作用,为此我们提出应用小剂量激素联合其他药物如神经节苷脂或者甚至是应用自噬激动剂取代激素治疗急性脊髓损伤可能起到很好的治疗效果,为治疗急性脊髓损伤提供新的方向。

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