在一项新的研究中，来自美国哈佛医学院和波士顿儿童医院的研究人员利用一种新的基因编辑方法挽救了患有遗传性听力丧失的小鼠的听力，而且在成功地做到这一点的同时没有产生任何明显的脱靶效应。这些被称为贝多芬小鼠(Beethoven mice)的动物因为具有相同的导致人类进行性听力丧失(progressive hearing loss)并且最终在20岁左右耳聋的基因突变而接受了这种方法的治疗。相关研究结果于2019年7月3日在线发表在Nature Medicine期刊上，论文标题为“Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss”。

这种新的方法涉及经典的CRISPR-Cas9基因编辑系统的一种优化的更加精确的版本，能够更好地识别在贝多芬小鼠中发现的这种引起疾病的基因突变。这种精确的工具允许科学家们选择性地让一个称为Tmc1的听力基因的缺陷拷贝失活，同时让它的健康拷贝发挥功能。值得注意的是，这些研究人员报道，他们的系统成功地在小鼠基因组的30亿个碱基中识别出Tmc1基因缺陷拷贝中单个错误的DNA碱基。

这些研究人员提醒说，即使是像这样的高精度基因编辑疗法在可用于人体之前，还有许多研究工作要做。不过，他们说，这项研究代表了一个里程碑，这是因为它极大地提高了标准基因编辑技术的功效和安全性。

哈佛医学院布拉瓦特尼克研究所转化医学科学教授David Corey说道，“我们的研究结果证实目前经典的CRISPR/Cas9编辑工具的这种更精确、靶向性更好的版本实现了前所未有的识别水平和准确性。”

此外，Corey及其团队表示，这些研究结果为使用相同的精确方法治疗由基因的单个缺陷拷贝引起的其他显性遗传的遗传疾病奠定了基础。

每个人都继承了同一个基因的两个拷贝---一个拷贝来自父亲，另一个拷贝来自母亲。在许多情况下，一个正常的基因足以确保正常的功能，让人体免于疾病。相反，在所谓的显性遗传性遗传疾病中，一个基因的单个缺陷拷贝就能够导致疾病。

论文通讯作者、哈佛医学院耳鼻喉科与神经病学教授Jeffrey Holt说道，“我们相信，我们的研究为一种治疗一系列由基因的单个缺陷拷贝引起的遗传疾病的超定向方法打开了一扇大门。这真地是精准医疗。”

携带有缺陷性Tmc1基因的小鼠被称为贝多芬小鼠，这是因为它们的疾病过程模拟了德国著名作曲家路德维希-范-贝多芬所经历的进行性听力损失。不过，贝多芬耳聋的原因仍然是一个猜测的问题。

在贝多芬小鼠中，它们存在的标志性缺陷是Tmc1基因的DNA序列中存在一个不正确的碱基---碱基A替换碱基T，即单个碱基错误表示着正常听力和耳聋之间的差异。

让Tmc1基因的突变拷贝失去功能或沉默足以保护贝多芬小鼠的听力，但是这如何在不会无意中让健康的基因拷贝失去功能的情况下完成呢?

双重识别

经典的CRISPR-Cas9基因编辑系统通过使用向导RNA(gRNA)来识别发生突变的靶DNA序列。一旦确定了靶DNA的位置，切割酶Cas9就会进行切割。

到目前为止，这些基因编辑器的准确度并不完美。这是因为引导酶Cas9到达靶位点的gRNA和切割靶DNA的酶Cas9并不完全精确，最终可能会切割错误的DNA位点。

为了克服这些挑战，这些研究人员采用了对最初由哈佛医学院病理学教授Keith Joung和哈佛医学院病理学助理教授Ben Kleinstiver开发的一种工具进行了改进，其中这种工具使用源自金黄色葡萄球菌的一种经过修饰的Cas9酶，而不是来自酿脓链球菌的标准Cas9。

为了提高检测和破坏的准确性，这种新的优化系统将两个层次的识别结合在一起---gRNA用于确定靶基因的位置和Cas9的一种修饰形式用于精确定位贝多芬小鼠中的特定DNA突变所在的位置。使用这种两种形式的识别可确保精确地和选择性地切割基因Tmc1的异常拷贝，而不影响它的健康拷贝。

论文第一作者Bence Gyorgy说道，“我们利用了这个系统识别突变DNA而非正常DNA的事实，并使用双重识别系统来提高精确度。这种方法在靶向突变基因方面产生了前所未有的特异性。”

在对具有和不具有这种贝多芬突变的细胞开展的一组初始实验中，这种工具准确地区分Tmc1基因的两个拷贝中的突变DNA和正常DNA。进一步分析显示，在含有这个基因的一个缺陷拷贝和一个正常拷贝的贝多芬细胞中，至少99%的分子“切割”仅发生在这个基因的缺陷拷贝中。

接下来，这些研究人员将这种基因编辑工具注射到含有或没有这种贝多芬突变的小鼠内耳中。DNA分析显示编辑活性仅发生在具有贝多芬突变的小鼠的内耳细胞中。在接受这种注射的没有这种突变的小鼠的内耳细胞中没有检测到编辑变化---这一发现证实了这种工具的精确度。

为了确定这种基因编辑疗法是否干扰了正常的基因功能，这些研究人员以没有携带贝多芬突变的小鼠为实验对象，刺激了来自这些接受这种治疗的小鼠的听力细胞(称为毛细胞)。这些细胞显示出不变的正常听力反应，从而证实这种基因编辑疗法对正常基因功能没有影响。

沉默贝多芬突变

为了测量这种基因编辑疗法是否在动物体内而不仅仅是在细胞中起作用，这些研究人员进行了金标准的听力测试。他们测量了这些小鼠的听觉脑干反应，以便捕捉了内耳毛细胞检测到多少声音并传递到大脑中。

如果不进行治疗，贝多芬小鼠通常在6个月大时就完全失聪。相比之下，没有这种遗传缺陷的小鼠在整个生命过程中都能保持正常的听力，并且可以检测到大约30分贝的声音(相当于耳语的声音水平)。

在接受这种基因编辑治疗两个月后，贝多芬小鼠的表现明显好于未治疗的携带这种基因突变的贝多芬小鼠。这些经过治疗的小鼠能够检测到约45分贝的声音(相当于正常谈话的声音水平)。听力保持最大的贝多芬鼠标能够听到25至30分贝的声音，几乎与健康的同龄小鼠无法区分。

总之，这些研究结果证实这种新的基因疗法有效地让Tmc1基因的缺陷拷贝沉默，并挽救了贝多芬小鼠的听力，使得它们免于在这种疾病中经常出现的快速死亡。

鉴于这种疾病以进行性听力丧失为特征，这些研究人员评估了这种治疗在数月内对疾病进展的影响。他们在小鼠出生后不久就提供这种治疗，并且每4周在接受治疗和未接受治疗的携带和未携带这种突变的小鼠中进行听力测试，持续长达6个月。

在第一个月，未经治疗的贝多芬小鼠能够听到低频声音但在高频时听力明显下降。到出生后6个月时，未经治疗的贝多芬小鼠失去了所有的听力。相比之下，经过治疗的贝多芬小鼠在低频时保持接近正常的听力，而且其中的一些甚至在高频率下仍显示接近正常的听力。

值得注意的是，经过治疗的没有携带这种贝多芬突变的小鼠没有因为这种基因治疗而出现任何听力损失---这一发现证实了这种治疗方法的安全性及其选择性靶向这个基因的异常拷贝的能力。更令人鼓舞的是，在接下来近一年的时间里，一小部分经过治疗的贝多芬小鼠保持稳定的接近正常的听力。

鉴于贝多芬突变的特点是内耳中听力细胞的逐渐恶化和死亡，这些研究人员使用电子显微镜可视化观察这些至关重要的听力细胞的结构。正如预期的那样，在未经治疗的贝多芬小鼠中，他们发现听力细胞逐渐丧失，它们的结构也逐渐恶化。相比之下，经过治疗的贝多芬小鼠和经过治疗的健康小鼠都保留了正常数量的具有完整或接近完整结构的听力细胞。

在最后的实验中，这些研究人员在一系列携带贝多芬突变的人体细胞中测试了这种治疗的效果。DNA分析显示这种治疗仅在Tmc1基因的突变拷贝中进行编辑，而正常的拷贝不受影响。

鉴于这种方法能够靶向单点基因突变，它也有望治疗15种其他形式的也由其他听力基因的DNA序列中的单碱基突变引起的遗传性耳聋。

此外，这些研究人员表示，他们的技术可能适用于由单点突变引起的其他显性遗传性遗传疾病。为了确定它的潜在用途，他们扫描了联邦ClinVar数据库---一个与人类疾病相关的所有已知基因突变的国家信息库。分析结果表明基于这种工具的特异性，它能够正确识别3759个缺陷的基因变异，这些基因变异总共导致五分之一的显性人类基因突变。

Holt说道，“毫无疑问，这是万里长征的第一步。但是我们在这项研究中的原理论证表明这种高度特异性、高度靶向的治疗方法经开发出来后能够选择性地抑制携带单点突变的基因，并有可能治疗许多其他形式的人类疾病。”