植入前遗传学诊断(PGD)是指在体外受精(IVF)过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行活检和遗传学分析，选择无疾病表型的胚胎植入子宫，从而获得表型正常子代的方法。PGD可以说是产前诊断的延伸，可有效地防止遗传性疾病患儿的出生，阻断致病基因的垂直传递，避免因引产给家庭，特别是女方带来的身心创伤。随着越来越多的医疗机构获得PGD的资质，我国PGD技术的开展日益广泛，其安全性也应逐渐引起重视。作为分子遗传和辅助生殖技术的融合点，PGD在临床应用中面临多个风险环节。本文就主要风险环节进行分析。

1PGD适应证的选择和遗传咨询的环节

PGD的适应证已从单基因疾病、染色体结构和数目异常、性连锁性疾病，扩展到人类白细胞抗原(HLA)配型以挽救同胞血液病患儿，以及肿瘤相关基因筛查以降低子代患病风险等。在该技术应用时，首先应在伦理上进行把控，如性连锁性疾病的男性患者的女性子代均为携带者，男性子代均为正常，是否需行PGD存在伦理的争议。

近年来基因测序技术蓬勃发展，极大地拓宽了PGD的适应证，也推动了PGD的发展，但国家法律法规和标准制定落后于技术的发展。各个遗传病研究机构出具的报告描述参差不齐，多数报告未对突变或染色体微缺失/重复的致病性进行详细的评估。由于目前缺乏中国人群的基因变异大数据，很多基因突变报告将不明确致病性的变异评估为临床意义未明。有些复杂报告，包含多个可能致病的变异。对于单基因遗传病报告中的变异，需要查阅海量文献、生物信息学数据库和相关软件判断其致病性和相关表型，通过家系共分离比对家系成员中基因型和表型的关系及某些变异(如深度内含子变异)，甚至要经过功能学或RNA组学验证其致病性。

确定不同变异的致病性是决定能否进行PGD的关键，同时还需要考虑现有PGD技术能否准确检测到该致病突变，避免由于适应证把控不准确导致PGD错误的风险。若对致病性评估错误，则有可能忽略真正的致病因素，导致漏诊或对非致病位点的筛选，造成过度医疗。因此，PGD适应证的选择应基于致病性明确、基因背景清晰，并且子代有一定再发风险的原则上考虑。已生育携带新生突变的患儿家庭，不应纳入PGD的范畴，应建议其寻求产前诊断。

临床上还可能遇到同时携带单基因疾病的染色体易位携带者的案例，自然妊娠产下一患儿夭折，在自诉病史时由于情感因素不愿提及或忽略描述遗传病症状，临床医生误认为仅由染色体易位导致流产，忽视了夫妻双方可能为罕见遗传病的携带者，增加了在PGD妊娠后出现不良妊娠结局的风险。因此，临床医生，特别是首诊医生，对患者遗传病指征的咨询非常重要。近年来，遗传咨询师这一行业逐渐引起广泛关注，国内相关的培训机构如雨后春笋般出现，但目前国家对这一职业的执业资格批准和专业背景限制还不明确。

在确定有进行PGD的适应证后，需要对夫妻双方提供相应的指导，包括PGD技术的各种遗传学检测方法、PGD和产前诊断技术相比的优势和局限性、发生错误的风险，强调PGD妊娠后仍需产前诊断以及PGD后可能无可用胚胎移植等。

2体外受精中胚胎培养和胚胎活检的环节

常规IVF时，大量未受精的精子黏附在透明带上，胚胎活检时可能存在精子的遗传物质带来的误诊风险。因此，目前PGD技术推荐使用卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术进行授精。

在胚胎培养、活检和冷冻、解冻过程中，每个步骤都需要强调流程管理以及双人核对。每个活检囊胚必须单独培养、冷冻，并且建议只有惟一的编号，以避免由于胚胎编号错误导致的严重后果。

胚胎活检是提供遗传物质供检测的环节，也是PGD的重要步骤之一。目前卵裂球活检也逐渐被囊胚期滋养外胚层(TE)活检所取代。TE活检是在囊胚期用激光法或机械法取5~10个细胞进行遗传学诊断。TE后期发育成绒毛和胎盘，所以活检对胚胎发育和种植潜能影响小，而且可用于诊断的细胞数量多，提高了诊断准确性。

囊胚活检同样存在风险。首先，囊胚培养条件要求高，不良的培养环境可能造成胚胎的耗损，以及增加印记基因病的风险;其次，囊胚发育速度不一致，需要操作者在不同的时间段分别活检发育速度快和慢的胚胎，活检后还需要逐个冷冻。因此，囊胚活检增加了技术员操作的步骤，有可能在流程上存在隐患，如遗漏个别发育速度慢的胚胎，故需要培养室在制度上予以保障;最后，TE后期发育为绒毛和胎盘，不能完全代表发育为胎儿的内细胞团，可能带来误诊的风险。TE和内细胞团两者之间染色体核型不相符率约4%。另外，不同TE部位也由于早期胚胎存在低比例的染色体嵌合，产生不一致的整倍体筛查检测结果，造成误诊或漏诊。活检过程中对部分细胞的牵拉和激光热切割也可能造成细胞核断裂，形成人为的染色体嵌合型。

3遗传学诊断环节

3.1 实验场地和操作的基本要求 PGD活检样本的DNA属于痕量样本。目前遗传学诊断的主要方法基本以扩增DNA为基础，所以实验过程极易受到污染。污染源主要来自实验者和实验场地气溶胶。在实验操作中，实验员手、口应与实验样本隔离，实验场地应按照卫计委临床检验中心规定的临床基因扩增检验实验室布局要求进行分区，并在实验前进行紫外线照射，且做好室内质控。

在活检后需要实验人员在显微镜下进行细胞固定或将活检细胞转移至离心管的缓冲液中进行后续实验操作。对操作者的操作技巧、熟练程度和样本接触耗材的低吸附性有一定要求。另外，由于实验条件可能存在气溶胶污染而可能导致标本污染，而避免气溶胶污染最简便方法的紫外线照射在胚胎培养区禁用，所以污染也是导致误诊的一大风险，故此步骤务必进行阴性对照质控。同时，也需要格外注意胚胎样本号码混淆造成误诊的风险。

3.2 诊断及结果分析的环节 胚胎活检后的DNA量极少，每个细胞约5~6pg，即使是囊胚活检，也只能提供5~10个细胞的样本量。1994年Ray等利用单细胞以PCR技术诊断囊性纤维病时，发现了等位基因脱扣(ADO)和优势等位基因扩增等极少量样本的特有现象，发生率为10%~25%，严重影响诊断准确率。PGD中应对的策略是增加取样细胞数，利用多重PCR进行连锁分析来降低单个位点ADO对误诊的影响等;但多重PCR需要耗费大量时间设计引物进行预实验。另外，在实验过程中容易被污染，造成误诊，需要阴性对照或空白对照质控。欧洲人类生殖与胚胎学会(ESHRE)的多中心数据统计了PCR-PGD误诊率约为0.1%。

近年来，高通量技术在PGD领域中的应用日益广泛。由于PGD中胚胎活检的样本量极少，无法满足高通量技术分析时的最少DNA量(200~300ng)的要求，因此在诊断前应用全基因组扩增(WGA)增加模板量成为目前的趋势。WGA的保真度并非100%，同样会有ADO和等位基因扩增偏好的风险，而PGD结果判读也依赖于WGA的质量，若WGA扩增效果差，也会出现误诊。一般来说，WGA扩增后均匀性越好，则染色体核型分析的结果越容易解读，但可能降低了覆盖率，影响单碱基水平的分析。

现有的高通量PGD技术包括微阵列-比较基因组杂交(array-CGH)、寡核苷酸多态(SNP)芯片以及二代测序(NGS)等技术。各种技术在染色体片段缺失重复的分辨率约在4Mb，小于4Mb极难分辨，Y染色体上位点探针少，也很难做出准确判断。有研究对array-CGH诊断结果进行FISH重验证，发现误诊率为1.9%，目前尚未见SNP array误诊率的相关报道。

改良的SNP芯片——核型定位芯片可用于单基因病诊断，通过比对家系成员SNP信息，构建单体型连锁分析进行筛选诊断，但局限于要有先证者DNA比对。另外，某些遗传病致病基因靠近染色体末端，可供单体型分析的有效SNP位点少，若这些位点出现ADO则误诊风险增加。基因内或附近的重组也会给诊断造成干扰。在杂交实验过程中仍有污染的风险，需要做好质控。

随着测序成本的降低和数据分析软件的优化，NGS已广泛应用到PGD领域中。NGS的特点是灵敏度高、通量高以及自动化程度高。NGS有对WGA扩增产物进行文库构建、加接头测序等步骤，面临与SNP芯片方法相同的ADO、实验污染和实验操作出错等风险，但最主要问题在于NGS数据的生物信息学分析上。与SNP芯片相同，目前NGS-PGD/植入前遗传学筛查(PGS)数据分析也仅能分辨染色体4Mb以上大小的重复和缺失，存在Y染色体诊断精度低的问题;另外，也无法区分二倍体整倍体和其他整倍体，不能发现单亲二倍体或无拷贝数变异的杂合性缺失。

通过NGS技术可以对胚胎染色体嵌合型的比例进行定量分析。胚胎植入前遗传学诊断国际学会(PGDIS)在2016年定义嵌合胚胎的分界点为20%和80%，在此嵌合比例之间即可报告胚胎染色体嵌合。NGS的各个环节，如WGA扩增、扩增产物建库以及数据分析等，都可能影响最终的诊断结果，而过于严谨的诊断将不可避免地会减少可移植胚胎数。

4移植胚胎选择的环节

随着囊胚活检技术的提高以及高通量技术筛查增加了对有发育潜能胚胎的选择，PGD后单个胚胎的植入率很高，因此强烈建议单囊胚移植。各个PGD中心应完善PGD后移植胚胎选择的制度。移植胚胎的选择应优先考虑诊断结果，其次考虑胚胎发育速度和形态。挑选移植胚胎需要临床和实验室技术员严格按照制度执行，并且在操作过程中进行双核对和签名，严格禁止非医疗指征的性别筛选。

在PGD中还存在单基因病或染色体病诊断后全部可移植胚胎均为染色体嵌合型的可能。PGDIS建议：仅有嵌合型胚胎时，优先选择嵌合单体(45，X嵌合除外)，可能导致单亲二体的染色体14、15嵌合三体，宫内发育迟缓有关的2、7、16嵌合三体，以及能存活的13、18、21嵌合三体不优先选择或不考虑移植。目前对移植嵌合型胚胎后流产组织染色体和活产胎儿染色体的研究还很少见，在嵌合胚胎的选择上还需要更多数据验证来确定可行性。

PGD技术是一把双刃剑，其安全性一直备受关注。随着技术的发展，检测技术的敏感性和可靠性也在不断提高，但在PGD诸多环节中需要通过各种手段来规避风险。目前国际上的相关法律法规和操作指南逐渐出台，而国内的管理办法、规范和操作指南也需要与时俱进，从而科学指导该技术的高速发展。

参考文献略。

来源：许言，徐艳文等，植入前遗传学诊断技术风险环节[J].中国实用妇科与产科杂志，2018，34(6)：595-598。