胎盘滋养细胞(trophoblastcell,TB)在母-胎界面中参与免疫耐受、营养传递等病理生理过程,其研究始于上世纪二十年代胎盘组织块体外培养的尝试。现在由胎盘绒毛(TCL-1、IST-1、HT等)或绒癌(BeWO、JAR、JEG等)获取的TB系已成为研究TB的重要工具。然而,TB在分化过程中表现出较大的形态功能差异,而母体细胞污染又大大影响了细胞纯度,原代细胞用于构建细胞系的可靠性曾受到广泛质疑。如何分选纯化不同类别的人胎盘TB成为进一步研究母-胎界面病理、生理机制的首要问题。

1滋养层细胞的概念与分类

TB分化始于桑葚胚。桑葚胚成为胚泡后,TB伴随胚泡侵入子宫形成双层,内层不接触母体为细胞滋养细胞(cytotrophoblastcell,CT),外层通过邻近的CT融合转化为合体滋养细胞(syncytiotrophoblastcell,ST)。ST群形成小梁侵入子宫内膜,CT随之扩展进入小梁并到达远端接触子宫内膜。小梁远端不接触绒毛间隙、不融合为ST而分化为有侵袭性的CT,成为绒毛外滋养细胞(extrvilloustrophoblast,EVT),绒毛内的CT则称为绒毛细胞滋养细胞(villousCT,VCT)。

2实验材料来源

TB的体外研究最早源于胎盘组织块离体培养,后来Thiede将早期胎盘绒毛从蜕膜分段剥离得到TB悬液,直到现在此方法仍在使用。然而,绒毛不仅含有VCT、ST,还有间质细胞、成纤维细胞、Hofbauer细胞等,并且绒毛分离过程掺杂母体细胞可能性极大,因此需要进一步分离纯化。

绒毛分离方法包括物理法和酶法。Penington等在分离牛胎盘TB时对酶法和物理法进行了比较,通过PI染色显示酶法的胞膜完整性明显高于物理法(95%vs10%)。单纯使用物理法较为少见,采用切碎后酶消化为常用方法。各个报道中的分离技术流程大致相同,只是在酶的选择、滤器孔径、离心转速等方面存在差异。Kliman等未经过过滤得到的大部分单核细胞直径约为10µm,少数大细胞直径为20~30µm。Potgens等使用40µm滤器过滤并纯化的VCT直径在12~16µm。相比之下40µm孔径的滤器应能得到较多单细胞。过滤的作用仅在于去除细胞团块,因此并非是影响产量的关键环节,产量应取决于标本量及消化程度。

3分离、纯化方法

3.1常用分离方法

早期较多应用梯度离心法分离细胞,目的在于去除溶剂及部分掺杂细胞,梯度离心液以Percoll和Ficoll最早开始使用,多项实验结果表明1.048~1.062g/mL密度层含有相对集中的TB。Blashitz等对1.079~0.977g/mL范围内的各层细胞分别进行特异性抗体标记,结果显示1.062~1.046g/mL密度层内的TB含量最多,但不超过50%。Manoussaka对1.013~1.092g/mL内的细胞标记后观察到,1.039~1.052g/mL密度层的TB含量最多(70%),但同样仍存在13%的上皮细胞和6%的白细胞以及1%的成纤维细胞。

除物理纯化方法外,免疫法是逐渐兴起的一种高纯度分选方法,包括基于磁珠吸附原理的免疫磁珠分离(immunomagneticseparation,IMS)和基于流式原理的荧光激发细胞分选技术(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)。该方法是利用不同细胞间的表面受体或胞内蛋白的表达差异,通过特异性抗体与磁珠或荧光素结合从而将不同分配进行选择、分离。相比之下,离心法的纯度太低,单独使用已不可靠;IMS、FACS单用或联用可以获得较高纯度,但也有自身局限性:①IMS较早用于细胞分选,是利用细胞表面受体结合被磁珠耦联的特异性抗体,在外加磁场的作用下阳性或阴性选择目标细胞,最后通过转移溶液达到分离细胞的目的。优点在于方便,不需复杂设备;缺点在于磁珠与待检细胞的浓度比例需反复试验,有时需数十倍于待检细胞浓度,增加了实验成本;并且TB有可能吞噬磁珠,IMS分选后可以观察到残留磁珠的存在;此外磁珠结合细胞后的大小无法直接测定,通过吸附分离柱时,经常出现细胞-磁珠复合物堵塞柱子的情况,因此柱子孔径、洗脱时间影响了实验进程。②FACS基于流式细胞术(flowcytometry,FCM)原理,优点是快捷、方便,不必再行FCM计数分析,可以快速分选并计数样本中的全部颗粒,适合临床使用。缺点是象限背景中的混杂散点较多,这些混杂都是阴性的,故而增加了偏倚,导致使用前需要对荧光补偿等参数进行设置;此外实施FACS的复杂、价格高昂的仪器设备限制了其广泛使用。

然而,单纯具备分析计数功能的FCM仪器应用广泛,是目前TB纯度鉴定的主要途径。1999年,国际胎盘协会联盟(theInternationalFederationofPlacentaAssociations,IFPA)提出评价TB分离技术的指标包括4个基本方面:细胞活性、纯度、产量和可复制性,FCM是衡量这些指标最客观的定量技术。

3.2细胞类型与标志物

不同纯化方案所使用的标本处理技术和分选技术大不相同,除此之外,为获得高纯度的TB细胞,细胞标志的选择尤为关键。特异性的细胞标志是分选纯化细胞的前提。目前较为确定并广泛接受的TB细胞标志物如下:①角蛋白7(cytokeratin-7,CK7)可以特异识别CT,包括VCT和EVT,由此可将CT与表达其他类型角蛋白的细胞区分开,如子宫腺上皮细胞呈CK7阳性,可通过人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)区别;②VCT呈CK7(+)HLA-Ⅰ(-)CD9(-),EVT为CK7(+)HLA-G(+)CD9(+),可以此区分两二者;VCT标志还有EGF、HAI-1等,EVT标志还有GB-1、c-erbB2等;③绒毛合体滋养细胞(villousST,VST)可通过PLAP、ePS、GB17等标志与VCT鉴别;④间充质细胞、成纤维细胞表达波蛋白(vimentin,VM),而TB全不表达,因此可利用VM(-)的特点分离TB;⑤白细胞表达CD45、Hofbauer巨噬细胞表达CD163,TB不表达这些标志,可以此区分;详见表1和表2。

表 1 由早期人工流产获得的TS细胞标志物

表 2 由足月胎盘获得的TS细胞标志物

针对阳性标志设计的分选方案可以直接获取目标细胞,但需斟酌抗体对胞内/外阳性标志的影响;阴性标志是TB不表达但混杂细胞特异性表达的标志,针对阴性标志的方案能够保证细胞不被抗体激活。然而,Trundley等在分离母-胎界面细胞的过程中没有观察到CD45受体的交联会影响蜕膜自然杀伤(NK)细胞的功能,但是目前缺少对TB结合抗体后功能是否有差异的研究。出于纯度考虑,IMS阴性选择后阳性选择或进一步阴性选择是必要的。总的来看,IMS以CD9、CD45或HLAⅠ作为阴性选择,剩余细胞按CK7(+)VM(-)进一步FACS纯化或鉴定是分选TB的可靠方法。若以CK7(+)作为TB特异性标志,良好的TB原代细胞纯度应>95%,低于50%的细胞系不能使用。

3.3分子标志的特异性

TB细胞的纯度由分选方法和细胞标志直接决定。目前,FCM结合特异性分子标志已应用于TB分选纯化,该方法可以识别母体外周血及新鲜离体胎盘灌注液中的胎儿VST微粒。Pritchard等利用FACS从母鼠肺中分离出胎鼠TB,结合基因表达芯片检测胎鼠细胞功能。参与血管发生和生成过程的Notch受体及配体被检测到在VST、CT中表达,并通过FCM定量检测方式得到验证。同样,结合FCM/FACS技术,研究显示参与侵袭的Galectin-1定位于TB细胞膜,参与细胞凋亡的IEX-1基因在TB中有表达,诱导凋亡的线粒体组分可能存在于VCT而非VST中。Rugg-Gunn等研究了不同来源(包括TB)干细胞表面蛋白的表达谱,并对这些表面蛋白的功能进行了分类,范围涵盖Integrin、FGF、Wnt、BMP、TGF-β、Notch等通路,可用于FCM分析,从而有助于进一步明确不同种系干细胞的细胞命运调节机制。

4展望

回顾TB分选方法的发展过程,现在尚无分离TB细胞的标准流程。激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)可以精确获取组织切片特定部位的细胞,已经应用于胎盘滋养细胞基因表达谱和蛋白质组学研究中,但LCM获取的细胞数量较少,适合直接研究分子水平的差异,能否用于TB细胞分选尚无研究。目前FCM/FACS在TB细胞分选中的应用较多,尤其是结合特异性分子标志可用于TB基因组和蛋白质组学研究,可以极大改善纯化技术,从而确保体外研究的可靠性。这些分子标志的揭示在TB增殖、凋亡和侵袭机制的研究中也将具有广泛应用前景。国内学者曾采用不同的胰酶消化及体外培养条件,简单、快捷地分别获得高纯度人早孕期VCT及EVCT,其应用价值值得深入研究。针对临床反复自然流产、胎儿发育受限、子痫前期等疾病的病理机制至今仍未完全阐明。TB作为母-胎界面中的主要构成细胞,揭示其与蜕膜免疫细胞的互相作用,有助于理解这些疾病的致病机制。并且,在生物样本库的协助下,利用冻存TB回顾研究这些疾病的病因也成为可能。因此,如何克服上述各种技术的局限性,更加便利地分离出高纯度的TB细胞应成为下一步需要解决的关键问题。