阿尔茨海默病(AD)是老年人中最常见的神经退行性疾病，其特点是突触退化、神经元死亡，并最终导致参与学习和记忆的大脑区域面积缩小。AD的大脑因存在导致认知损害的神经纤维缠结和细胞外淀粉样β(Aβ)斑块而与其他神经退行性疾病区分开来。然而，AD的分子机制仍然难以捉摸。

近期，《Nature Communications》期刊上发表了题为“Enhanced activity of Alzheimer disease-associated variant of protein kinase Cα drives cognitive decline in a mouse model”的论文，作者团队利用基因编辑将M489V功能获得型变体引入内源性PKCα，以确定这种单一的氨基酸变化，适度提高的激酶活性，是否足以驱动小鼠模型中的AD病理。

生物化学、磷酸化蛋白质组学、电生理学和行为学研究显示，这种AD变体的存在所导致的PKC活性的提高，使大脑中PKC底物的磷酸化增加，神经元变性，增强Aβ驱动的突触抑制以及认知能力的下降，这在AD的转基因小鼠模型中表现得更为明显和迅速。这些数据表明PKCα活性的增强足以驱动小鼠模型的认知能力下降，并支撑将PKCα的抑制作为AD的一种潜在治疗方法。

研究背景

目前，AD发生发展最具说服力的假说之一是β和γ分泌酶对淀粉样前体蛋白(APP)的不当处理所产生的Aβ 42肽的异常积累。通常，可溶性Aβ低聚物被认为是引发疾病及其伴随症状的神经毒性物质。然而，Aβ斑块是相对惰性的，但它可以作为可扩散的低聚物的储存库。APP和presenilin基因(PSEN1和PSEN2)是第一个显示出有与AD相关变体基因，并对进展性淀粉样蛋白级联假说和建立Aβ斑块的错误处理和沉积与AD发展之间的联系至关重要。

尽管这些变体在AD病例中占的比例相对较低，但它们的鉴定为探索与该疾病相关的复杂遗传学找到方法。APOE的多态性在早期也被确定为是AD的主要危险因素。全基因组测序工作正在确定与AD风险相关的其他遗传变异，包括TREM2、PLCG2和ABI3等基因的多态性。在最近一次寻找与AD相关的罕见功能变异中，对来自NIMH队列的410个家庭中受影响和未受影响的兄弟姐妹的全基因组测序数据进行分析，发现了PKCα的变异。其中一个变体M489V(rs34406842，在gnomad中的小等位基因频率为0.00095)只存在于4个家庭的受影响成员中，在未受影响的成员中不存在，并与AD患者的情感状态有关联。蛋白激酶的高可成药性使PKCα成为AD潜在的治疗靶点。

PKCα被称为传统PKC，属于依赖Ca2+和二酰甘油(DG)的PKC同工酶。这些Ser/Thr激酶从受体介导的膜磷脂水解中转导信号，从而产生它们的激活剂，即Ca2+和DG。传统的PKC同工酶在维持细胞平衡方面起着关键作用，它们的活动经过微调，调节着细胞死亡和生存之间的平衡。它们通过一系列有序的磷酸化形成一种稳定的、自抑制的构象，从而对第二信使作出快速和可逆的反应。异常的PKC如果没有适当的自我抑制，就会通过质控途径降解。尽管PKC历来被认为是致癌的，但最近的分析表明，PKC同工酶具有抑制肿瘤的作用。值得注意的是，与癌症有关的突变通常是功能缺失表型，而PKC同工酶蛋白水平的提高使许多癌症患者的生存率提高。因此在癌症中抑制PKC是不成功的，在某些情况下会使病人的结局恶化。识别出与AD共存的PKCα活性增强变体，就有可能使AD患者从原本用于癌症临床试验的PKC抑制剂中获益。

结 果

结果一：M489V PKCα小鼠大脑磷酸化蛋白组的改变

PKCα M489V是一种与AD相关的突变，已被证明比野生型(WT)PKCα的催化活性更高，其机制是不损害其稳定性，使其能够逃避细胞对异常活性PKCα的稳态调控。为了了解由于PKCα活性增加而在大脑中发生的磷酸化事件，我们分离了携带WT和M489V PKCα的C57BL/6小鼠3月龄时的大脑，并对其进行了磷酸化蛋白质组学分析。简而言之，我们从脑裂解液中提取和消化蛋白质，用TiO2富集磷酸肽。用TMT 10-plex试剂标记未富集的肽和磷酸肽，并通过液相色谱-MS2/MS3(LC-MS3)进行分析，对蛋白质组和磷酸化蛋白组进行量化。

结果二：M489V PKCα小鼠海马神经元的棘突密度下降

鉴于突触后蛋白是M489V大脑磷酸化蛋白组分析中变化最大的蛋白之一，作者研究了M489V小鼠的突触与WT小鼠相比是否有形态上的改变。大脑中兴奋性突触的突触后部分是由树突棘组成的。棘突的形态是提示相关突触稳定性，可塑性和强度的一个指标。大脑中的大部分兴奋性突触存在于树突棘上，因此，海马区树突棘密度的调节被认为在学习和记忆中起着核心作用。为了更好地了解PKC活性增强与神经变性之间的联系，作者检测了4.5月龄的雄性WT小鼠和PKCα M489V变体小鼠的海马神经元的棘突密度。通过对神经元突起的荧光染色，作者观察到与WT小鼠相比，M489V同型小鼠的棘突密度略有下降(9.81±0.02%)，但具有统计学意义。

此外，对分离的海马进行的蛋白印迹分析显示，与WT相比，M489V的样品的PKCα中，PKC底物的磷酸化普遍增加。MARCKS在Ser159/Ser163的磷酸化也在PKCα M489V海马样本中增加，这与全脑磷酸化蛋白组学数据相一致，并且以前也通过Western blot验证过。此外，与WT小鼠相比，PKCα M489V海马中的细胞外信号调节激酶(ERK)1/2(一种MAP激酶家族成员)的磷酸化增强。总之，PKCα M489V变体小鼠显示出棘突密度降低，以及调节神经元的蛋白质的磷酸化增强，这是阿尔茨海默病的一个重要标志。

结果三：C57BL/6中的PKCα M489V小鼠的认知能力受损

由于海马的棘突密度下降与学习能力下降相关，作者接下来评估PKCα M489V变体是否会影响认知能力。作者检测了WT和M489V小鼠在Barnes迷宫中的行为表现，这个测试被广泛用于评估AD的空间学习和记忆。在这个测试中，小鼠被训练使用迷宫周围的不同线索，在一个圆形平台周边的20个孔中找到一个逃生盒。记录小鼠在每个象限(目标象限与非目标象限)寻找洞的时间。相对于迷宫的其他区域，认知完整的小鼠在目标象限花费更多时间，而认知受损的小鼠不能很好地区分四个象限。所有年龄段的WT小鼠在这个测试中表现良好，在目标象限的时间大约是其他象限的两倍。与此形成鲜明对比的是，随着年龄的增长，携带M489V突变的小鼠在目标象限的时间逐渐减少，以至于在12个月时，它们不再能区分目标象限和其他象限。甚至在3个月大时，它们识别目标象限的能力也比WT小鼠低(在目标象限的时间分别为34±2%和41±5%)。在目标象限的时间减少并不是运动能力受损的反映，因为在Barnes迷宫探针测试和独立的活动测试中，WT和M489V小鼠的活动水平是一样的。此外，M489V小鼠并没有在明/暗测试评估中表现出焦虑的增加。因此，与WT小鼠相比，M489V小鼠的学习和记忆受损，但在活动能力或焦虑方面没有改变。这些结果表明，与AD相关的PKCα突变M489V足以导致C57BL/6小鼠的认知能力下降。