北京佑安医院 赵秀英

　　手足口病是一种由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主,流行无明显地区性，一年四季均可发病，但以夏秋季多见，冬季发病较为少见。本病多数患者症状轻微，以发热和手、足、188体育平台论坛 等部位出现皮疹或疱疹为主要特征，少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等。引起手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组（CoxA）和埃可病毒（Echo）的某些血清型。EV71病毒是最难鉴定的肠道病毒之一，可引起与脊髓灰质炎病毒感染相同的急性驰缓性麻痹等临床症状，目前其感染引起重症病例的比例较大，故在对中枢神经系统疾病进行临床诊断时，首先须行病原学判断。本文主要介绍如何规范地采集手足口病患者的病原学样本。

　　赵秀英主任医师于2005年6月毕业于香港大学微生物学系，获理学博士学位，现为北京佑安医院临床检验中心副主任、首都医科大学临床检验学系副教授、首都医科大学硕士研究生导师。主要研究方向为感染与免疫、分子生物及免疫学诊断技术。

　　2011年，赵秀英副教授入选北京市“十百千”卫生人才选拔经费“百”层次培养计划及北京市卫生系统高层次卫生技术人才学科骨干项目。先后承担首都医学发展科研基金联合攻关、国家自然科学基金、北京市自然科学基金及“十一五”肝炎、艾滋病科技攻关等多个项目。已在国内外核心期刊发表论文50余篇，主编并出版专著两部。

　　病例讨论

　　患儿男性，3岁，因手掌出现水疱样皮疹，伴188体育平台论坛 溃疡、发热、头痛、呕吐1天入院。

　　既往史 发病前1周其幼儿园同班同学曾被确诊为手足口病。

　　查体 入院时患儿神志清楚，脑膜刺激征阳性。

　　实验室检查 血常规示白细胞（WBC） 3.9×109 个/L，中性粒细胞占60%。尿、便常规无异常，肝功能及血生化正常。

　　入院诊断 手足口病，重型。

　　病情变化 入院后第1天与第3天采集咽拭子、第2天采集脑脊液行EV71与柯萨奇病毒A组16型（CA16）核酸检测，结果均为阴性。而脑脊液检查显示，WBC为157个/μl（其中多核细胞占62%，单核细胞占38%），蛋白为22 mg/dl，糖为81 mg/dl。

　　入院3天后，患儿意识发生改变，第4天出现阵挛性抽搐，随后昏迷，脑电图示弥漫性高幅慢波。予镇静药、甘油及地塞米松治疗。入院第2周，意识逐渐恢复，但出现躯体性共济失调，不能坐立，肢体肌力减退，此时查EV71 IgM为阳性。而后神经系统异常逐渐恢复。依据血清学检查及表现，确诊为EV71引起的全脑炎和脑干脑炎。

　　问题 为何早期检测EV71与CA16核酸结果均为阴性？

　　样本类型及采样方法

　　临床对手足口病的病原学诊断包括：从患者血清、脑脊液、咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子等标本中检测到病原核酸；自患者血清中检测到特异性IgM抗体；患者急性期与恢复期血清IgG抗体有4倍以上的升高。

　　手足口病患者的其他实验室检查缺乏特异性，早期患者可能出现外周血WBC总数与淋巴细胞下降，血涂片可见单核异型淋巴细胞，病程持续较长或出现严重合并症者或有细菌或真菌感染表现，此时WBC可能升高。少数患者伴不同程度的肝脏或心肌损伤，转氨酶或心肌酶谱可轻度升高。

　　目前，对手足口病患者进行EV71和CA16的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测仍是其病原学诊断的主要方法，但部分临床症状符合手足口病诊断者的病原体EV71和CA16核酸检测结果为阴性。这不但与样本类型、采样时间、检测次数及患者病情有关，且也可能是患者感染了EV71和CA16之外的肠道病毒。

　　下面介绍一下在采集不同标本过程中的注意事项，只有全科医生掌握了正确的标本采集方法，才能真正让标本监测发挥其作用。

　　正确的标本采集方法

　　咽拭子标本

　　尽量采集患者发病3日内的咽拭子标本用于病原学检测。相对于普通棉拭子，尼龙植绒拭子的采集与运送效果更好，尤其是不能及时送检或放置时间较长的样本。

　　取样时适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体，避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5 ml保存液（即含5%牛血清的维持液或生理盐水）的15 ml外螺旋盖采样管，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥且注意低温保存，因肠道病毒为RNA病毒，在体外或干燥环境下生存力较弱。

　　咽拭子样本也可用于病毒抗原的早期检测。这须用试剂盒专用的病毒裂解液对样本进行处理，不可直接使用上述保存液中的样本检测病毒抗原。

　　脑脊液标本

　　对于出现神经系统症状者，可采集脑脊液标本进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3 d内，采集量为1.0~2.0 ml，采集后应立即装入带垫圈的无菌冻存管中。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。

　　疱疹液

　　疱疹液可用于病毒分离培养，也可用于RT-PCR检测。应先用75%的酒精对疱疹周围皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破，用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装3~5 ml保存液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。

　　血清标本

　　血清标本用于通过免疫学手段检测EV71和CA16感染后的抗体。

　　采集急性期（发病0~7 d）和恢复期（发病14~30 d）双份配对血清用于阐明和分析EV71或CA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化。IgM抗体阳性有助于早期诊断，IgG抗体对流行病学调查有重要意义。

　　采集3~5 ml静脉全血，置于真空无菌采血管中；自凝后，分离血清，将血清移至2 ml外螺旋的血清保存管中，将其置于-20 ℃以下冰箱中冷冻保存。血清样本一般不适于检测病毒核酸或抗原。

　　粪便或肛拭子标本

　　采集患者发病3 d内的粪便或肛拭子标本，用于病原检测，肛拭子采样也推荐使用尼龙植绒的采样拭子。

　　从患者肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有3~5 ml保存液的采样管中，旋紧管盖以防干燥。有研究显示，使用粪便行肠道病毒核酸检测的阳性率高于咽拭子检查，采样时间可延长至发病后5 d。因肠道病毒易于在胃肠道或鼻咽部存在，有时可在这些部位生长数周~数月，故须在这些部位进行病毒分离和进行RT-PCR检测；即使结果阳性，解释时还应谨慎，尤其是粪便检测结果，也许今天患者粪便中发现的病毒是几周前发生的感染。