【摘要】  目的  研究胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）基因在非酒精性脂肪变性肝细胞模型中的表达变化及其意义。方法  用油酸诱导永生化人肝细胞（IHH）建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型，油红O染色和细胞内甘油三酯含量检测观察细胞脂肪变情况。IHH细胞分为对照组和NAFLD组，对照组细胞以DMEM/F12培养基培养，NAFLD组给予油酸0.5 mmol/L处理72 h。采用逆转录酶-聚合酶链反应及Western blot和免疫荧光染色方法检测IGF-1和IGFBP-3在两组细胞中的mRNA及蛋白质表达变化。组间均数比较采用t检验。结果  0.5 mmol/L油酸可成功诱导IHH细胞脂肪变性，油红O染色显示细胞内脂肪滴明显增多，细胞内甘油三酯含量从对照组的（150.2 ±15.6）μg/mg升高到（275.7 ±27.2）μg/mg（t= 21.67，P＜0.01）。油酸诱导后，NAFLD组细胞中IGF-1和IGFBP-3的mRNA相对表达量（分别为0.76 ±0.04和1.58 ±0.93）均较对照组（分别为4.82 ±1.51和5.41 ±1.37）明显下降，t值分别为17.915和12.893，P值均＜0.01；IGF-1和IGFBP-3的蛋白质相对表达量（分别为1.00 ±0.29和0.65 ±0.36）也较对照组（分别为2.56 ±0.71和1.23 ±0.91）明显下降，t值分别为29.17和32.12，P值均＜0.01。免疫荧光染色结果也证实NAFLD组细胞中IGF-1和IGFBP-3的蛋白质表达较对照组明显下降。结论  非酒精性脂肪变性肝细胞模型的IGF-1和IGFBP-3表达下降，为深入研究临床上部分非酒精性脂肪肝病儿童身高受限的机制提供了实验基础。

　　【关键词】   脂肪肝；  胰岛素样生长因子1；   胰岛素样生长因子结合蛋白质3；   永生化人肝细胞

　　Expression and significance of insulin-like growth factor-1 and insulin-like growth factor binding protein-3 in hepatocyte steatosis model    ZHANG Qiong, ZHANG Zhi-xin, FANG Qing, GAO Fu-yun, ZHAO Qiu-ling, YANG Ye, SU Hui-min, LIU Ying-ke. Department of Pediatrics, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

　　Corresponding author: ZHANG Zhi-xin, Email: zhangzhixin032@163.com

　　【Abstract】  Objective    To investigate the expression of IGF-1 and IGFBP-3 in nonalcoholic fatty steatosis hepatocyte models induced by oleic acid. Method   Nonalcoholic fatty steatosis hepatocyte models induced by oleic acid on immortalized human hepatocyte, Oil red O staining and intracellular triglycerides were detected for observing the situation of IHH cells fatty degeneration. IHH cells were divided into control group, NAFLD group, which the control group cultured in DMEM/F12 medium, NAFLD group were treated with oleic acid, 0.5 mmol / L treatment for 72 h. The expression of mRNA and protein of IGF-1 and IGFBP3 were measured by immunofluorescent staining, Western blot and RT-PCR methods. Between the two groups were compared using the t- test. Results  The steatosis models of the hepatocytes were established successfully  with 0.5 mmol/L oleic acid. Lipid droplets were observed through Oil red O staining. The level of hepatocyte TG was increased (275.7 ± 27.2) μg/mg from (150.2 ± 15.6) μg/mg (t = 21.67, P < 0.01). Compared with the control group, the mRNA of IGF-1 (0.76 ± 0.04 vs 4.82 ± 1.51, t = 17.915, P < 0.01), IGFBP-3 (1.58 ± 0.93 vs 5.41 ± 1.37, t = 12.893, P < 0.01) and protein expression of IGF-1 (1.00 ± 0.29 vs 2.56 ± 0.71, t = 29.17, P < 0.01), IGFBP-3 (0.65 ± 0.36 vs 1.23 ± 0.91, t = 32. 12, P < 0.01) significantly decreased in oleic acid-treated group. The results of immunofluorescence staining also confirm the significantly decreased protein expression of IGF-1 and IGFBP-3 in NAFLD group compared with control group. Conclusion  The expression of IGF-1 and IGFBP-3 decreased in nonalcoholic fatty steatosis hepatocyte models, which will provide the experimental basis for the further study of the mechanism of the limited height of some children with non-alcoholic fatty liver disease in clinical.

　　【Key words】   Fatty liver;    Insulin-like growth factor-1;    Insulin-like growth factor binding protein-3; Immortalized human hepatocyte cells

　　儿童肥胖已成为日益引人关注的社会健康问题，其可导致多个脏器损害，其中非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患病率较高、病变出现较早。我们在临床上发现部分NAFLD患儿身高增长缓慢，就诊时身高常低于同龄者。既往已有NAFLD儿童存在生长激素释放抑制的报道，但其具体机制不明[1-2]。关于儿童NAFLD，以往的研究主要集中于该病与胰岛素抵抗、脂质代谢、氧化应激及各细胞因子等的关系，很少涉及对生长影响的研究。生长激素（growth hormone，GH）-胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）轴是控制人体出生后生长最主要的内分泌轴，其功能失常是引起儿童身材矮小的主要原因。IGF是下丘脑垂体分泌的GH发挥生物学效应的内分泌介质，在儿童生长发育过程中发挥着重要的作用。循环中约90%以上的IGF-1和胰岛素样生长因子结合蛋白3（insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）都是由肝脏分泌[3]。IGF-1与IGFBP-3结合后，作用于生长板，刺激软骨细胞的增殖，从而发挥GH-IGF-1轴的促生长作用。据此，我们用永生化人肝细胞（immortalized human hepatocyte，IHH）构建非酒精性脂肪变性肝细胞模型，以IGF-1和IGFBP-3为主要观测指标，对NAFLD的生长障碍调控机制进行研究，探究NAFLD儿童生长障碍的调控机制。

　　材料与方法

　　1. 细胞和主要试剂：IHH细胞（专利号：20091 0091343）由中日友好医院娄晋宁教授惠赠。油酸购自美国Sigma公司，DMEM/F12培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司，BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Novagen公司，甘油三酯（TG）检测试剂盒购自北京普利莱基因技术公司，总RNA提取试剂Trizol购自日本BioFlux公司，逆转录试剂盒（AMV）和Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，兔抗人IGF-1抗体（sc-9013）、兔抗人IGFBP-3抗体（sc-9028）、小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体、山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP）和山羊抗小鼠IgG-HRP均购自美国Santa Cruz公司，其他试剂购自北京化学试剂公司。

　　2. IHH的培养：IHH培养于IHH完全培养液，由DMEM/F12培养基添加以下成分：10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，15 mmol/L HEPES，0.1 mg/ml L-精氨酸，4μg/ml胸腺嘧啶，1μmol/L地塞米松，5μg/ml ITS，0.1 mg/ml促肝细胞生长素。于37℃、体积分数5% CO2条件下培养。考虑到完全培养基中含有的生长因子可能会影响到肝细胞分泌IGF-1，改为DMEM/F12培养基培养。

　　3. 细胞模型的建立及分组：取生长期细胞分为2组进行试验，对照组细胞以DMEM/F12培养基培养，NAFLD组给予油酸0.5 mmol/L处理72 h，实验重复3次。

　　4. 脂肪变性肝细胞病理学改变：将对数生长期的IHH细胞以2.0×105个/孔的密度接种于铺有细胞爬片的6孔细胞培养板中，按实验分组处理细胞，Hank′s液洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定30 min。60%异丙醇漂洗。室温下油红O避光染色30min，60%异丙醇漂洗，苏木素复染细胞核，显微镜下观察细胞内脂滴形成情况。

　　5. 肝细胞内TG含量变化：将对数生长期的IHH细胞以2.0×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，按实验分组处理细胞。TG含量检测严格按照试剂盒说明书进行操作，蛋白含量检测严格按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作。肝细胞内TG含量以TG含量/蛋白质含量的比值表示。

　　6. 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞内IGF-1和IGFBP-3的mRNA表达：收集细胞，使用Trizol提取细胞总RNA，RNA操作相关物品均为RNAse Free，紫外分光光度计测量样品总RNA的A260/A280值均在1.8～2.0。总RNA定量后，按照Promega RT-PCR（AMV）试剂盒说明操作进行逆转录。IGF-1、IGFBP-3和内参照的引物序列及反应条件见表1，引物由上海生工生物工程公司合成，产物－20℃保存备用。取PCR产物10μl行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描电泳结果。

　　7. Western blot检测细胞内IGF-1和IGFBP-3的蛋白质表达：将对数生长期的IHH细胞以2.0×106个/孔的密度接种于T25细胞培养瓶中，按实验分组处理细胞。收集细胞，每瓶中加入300μl含十二烷基硫酸钠的RIPA裂解液，收集于干净的1.5 ml离心管中，经超声粉碎后置于冰上裂解30 min。4℃、12000 r/min离心15min，取上清液。BCA法蛋白定量后取80μg蛋白进行加二烷基硫酸钠-聚丙稀乙胺凝胶电泳，电泳完毕后以15 V恒压30min半干转印至PVDF膜，将膜用5%脱脂奶粉常温下摇床封闭2 h后加入兔抗IGF-1多克隆抗体、兔抗IGFBP-3多克隆抗体（稀释比例均为1∶50），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min；第二抗体孵育于常温下反应1 h，TBST洗膜3次，每次15min，最后以化学发光法显影。

　　8. 免疫荧光染色检测细胞内IGF-1和IGFBP-3的表达：将对数生长期的IHH细胞以2.0×104个/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，按实验分组处理细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次2 min，冰甲醇固定30min；PBS洗3次，每次2 min，1%胎牛血清（BSA）室温封闭30 min；加入第一抗体（用含1%BSA的PBS稀释至1∶50），4℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5 min，加第二抗体（用含1%BSA的PBS稀释至1∶200），避光40 min；PBS洗3次，每次5 min，在荧光显微镜下，用480 nm波长蓝光激发、拍照。

　　9. 统计学方法：采用SAS8.0和SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（x ±s）表示，组间均数比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

　　结    果

　　1. 油红O染色结果：光镜下可见脂滴为桔红色或红色。对照组细胞边缘清晰，胞质丰富，核膜完整，核大，可见核分裂相，细胞内未见红色脂滴（图1A）。NAFLD组培养72 h后，细胞核变大，细胞内可见脂肪变细胞，细胞质内聚集了大量橘红色脂滴，伴脂滴融合现象（图1B）。

　　2. 培养肝细胞内TG含量变化：与对照组相比，NAFLD组肝细胞中TG含量由（150.2 ±15.6）μg/mg升高到（275.7 ±27.2）μg/mg，差异有统计学意义（t = 21.67，P＜0.01），见图2。

　　3. 非酒精性脂肪变肝细胞内IGF-1和IGFBP-3的mRNA表达：RT-PCR结果显示，NAFLD组脂肪变性肝细胞内IGF-1和IGFBP-3的mRNA相对表达量较对照组明显下降，分别为0.76 ±0.04比4.82±1.51和1.58 ±0.93比5.41 ±1.37，t值分别为17.915和12.893，P值均＜0.01，见图3。

　　4. Western blot测定小檗碱对脂肪变肝细胞内IGF-1和IGFBP-3蛋白表达的影响：Western blot分析结果显示，蛋白表达与mRNA表达趋势基本一致，油酸作用72 h后，脂肪变性肝细胞内IGF-1和IGFBP-3 的蛋白质相对表达量较对照组显著下降，分别为1.00 ±0.29比2.56 ±0.71和0.65 ±0.36比1.23 ±0.91，t值分别为29.17和32.12，P值均＜0.01，见图4。

　　5. 免疫荧光染色测定非酒精性脂肪变肝细胞内IGF-1和IGFBP-3的表达：对照组和NAFLD组均可见IGF-1和IGFBP-3蛋白阳性细胞表达，阳性细胞以胞质表达为主。NAFLD组细胞IGF-1和IGFBP-3的蛋白质表达较对照组显著下降（图5）。

　　讨    论

　　膳食结构及生活方式的改变使儿童营养不平衡相关疾病，尤其是儿童肥胖的发生率逐年上升。Barron等[4]报道，爱尔兰17.8%的儿童超重，其中单纯性肥胖儿童占6.8%。侯冬青等[5]的研究结果显示，采用世界卫生组织最新的标准统计，北京市2～18岁人群超重率和肥胖率分别为12.2%和7.0%，学龄儿童，尤其是10～12岁男生的超重率合并肥胖率高达36.1%。肥胖是导致儿童和青少年患上诸多成人慢性病的主要原因。与正常体质量儿童比较，肥胖儿童患高血压、血脂异常和2型188bet在线平台网址 的概率分别增加5.4倍、3.8倍和2.8倍，患脂肪肝的概率增加51倍。

　　本实验采用0.5 mmol/L油酸诱导IHH细胞72h，与对照组相比，NAFLD组细胞内脂肪滴明显增多，细胞内TG含量增高到，与Zheng等[6]的报道一致，表明本次实验成功构建了建立非酒精性脂肪变性肝细胞模型。另外，以往的非酒精性脂肪变性肝细胞模型多使用肝癌细胞HepG2或肝细胞株L02，本次实验使用的IHH细胞系是利用基因转移技术对原代培养的人肝细胞转染永生化基因和人端粒酶逆转录酶，具有正常人肝细胞的基本生物学特性和主要的功能特性，具备成为生物人工肝细胞材料的可行性[7]。利用这种细胞系构建的肝脂肪变性细胞模型能更好的再现真正意义上的“肝”功能。由于NAFLD治疗药物存在肝损害等不良反应，限制了其在儿童中的使用。目前，对儿童NAFLD尚无特效药物，构建具有生物学功能的脂肪肝细胞模型将为防止儿童脂肪肝病提供实验基础。

　　IGF作为生长激素生物效应的中介，在正常儿童生长发育中起重要调节作用。我们在前期研究中发现，高脂饮食诱导的NAFLD幼鼠体长增长缓慢[8]。潘逸茹等[9]测定60例NAFLD患者和40名健康对照者的血清IGF-1水平，发现NAFLD组的血清IGF-1明显低于正常组。还有文献报道NAFLD是先天性IGF-1缺失患儿的常见并发症，IGF-1和生长激素的水平越低则NAFLD的发生程度越严重[1-2]。在儿童生长发育过程中，肝脏产生的IGF-1有99%与IGFBP-3结合，介导作用于生长板，刺激软骨细胞的增殖，从而发挥IGF-1的促生长和合成代谢作用。Burghardt等[10]建立IGF-1基因敲除鼠，发现血清IGF-1水平明显下降，身长下降40%，骨骺板宽度下降38%，骨的生成速度亦明显低于对照组。Govoni等[11-12]通过灭活鼠软骨细胞和成骨细胞中IGF-1的活性，发现身长分别降低7%和14%，骨骺板宽度分别降低7%和20%。在临床中，生长激素缺乏症所致矮小的患儿中可以发现IGF-1水平低下，说明IGF-1对生长有促进作用[13]。在美国，重组人IGF-1已经成为一种被FDA批准运用治疗生长激素不敏感所致矮小症的药物，但国内尚未批准其应用。因此，检测儿童IGF-1和IGFBP-3的表达水平将为进一步研究部分脂肪性肝病儿童生长受限提供实验数据支持。

　　本实验验证了非酒精性脂肪变性肝细胞模型IGF-1和IGFBP-3的表达水平下降，这与临床上部分NAFLD儿童生长障碍，身高受限在理论上是一致的。但IGF在脂肪肝儿童生长发育过程中的具体作用机制，临床上部分脂肪性肝病儿童身高受限的现象是否与IGF信号通路改变相关，以及IGF-1对非酒精性肝脂肪变性幼鼠模型的调控机制还有待于进一步的实验验证。

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