1.甲基化的概念

　　甲基化是指在底物中添加甲基集团的反应，包括DNA甲基化和蛋白质甲基化。哺乳动物DNA甲基化主要发生在CpG位点，使胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。通常，甲基化修饰会干扰转录因子与基因的结合或者招募甲基DNA结合蛋白等形成转录抑制复合物，抑制基因启动子的活性。但在某些情况下，DNA甲基化也能激活基因的转录3。DNA甲基化修饰由DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)催化完成，相对较稳定，但并非不可逆转。

　　哺乳动物DNMTs主要包括三种：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,其中DNMT1主要参与甲基化状态的维持，后两者则与新的甲基化形成相关。蛋白质的甲基化修饰发生在蛋白质的精氨酸或赖氨酸残基上，分别由蛋白精氨酸甲基转移酶和赖氨酸甲基转移酶催化完成。其中，研究最多的是组蛋白甲基化修饰，即将甲基由&腺苷甲硫氨酸转移至组蛋白上。组蛋白甲基化修饰的具体作用取决于甲基化位点。

　　组蛋白H3的赖氨酸9或27位点的甲基化(H3K9或H3K27)和组蛋白H4的赖氨酸20位点的甲基化(H4K20)多为转录抑制调控，而组蛋白H3赖氨酸4、36和79位点(H3K4、H3K36和H3K79)的甲基化则多与转录激活相关。DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰均属于表观遗传学的重要组成部分，在转录和翻译水平调控基因表达。

　　 2.甲基化修饰参与神经病理性疼痛的调控

　　DNA甲基化与神经病理性疼痛神经病理性疼痛研究的一大难题是机制的复杂性，神经通路中任何环节的异常均有可能导致神经病理性疼痛的发生。目前研究认为大脑、脊髓和背根神经节(dorsalrootganglia,DRG)内疼痛相关分子的改变在神经病理性疼痛中发挥关键作用。

　　DRG是联系外界环境刺激与中枢神经系统的枢纽。Pollema-Mays等首次探讨了成年大鼠DRG内三种DN-MTs在疼痛中的变化。与假手术组比较，部分坐骨神经损伤(sparednerveinjury，SNI)大鼠术后三种DNMTs表达上调，但持续时间不同;DNMT3b术后1周即明显升高，持续至观察结束(术后4周)，而DNMT3a和DNMT1的表达增加持续时间较短且程度较轻，术后2周消失。这提示外周神经损伤引起的神经病理性疼痛中，DRG内不同DNMTs发挥的作用可能不同，但其具体机制仍待进一步研究。除外周神经损伤外，肿瘤也是引起神经病理性疼痛的重要原因。

　　Zhou等在癌性痛模型中发现肿瘤细胞注射不仅可使大鼠产生痛敏现象，同时腰段DRG内嘿呤受体(purinergicreceptor,P2X3R)和核因子(nuclearfactor-kappaB,NF-kB)亚基p65的表达明显升高，进一步研究表明DRG内DNMT3a和3b减少，p65与P2X3R基因结合增加。因此推测DNMT3a和DNMT3b减少导致P2X3R基因启动子区甲基化水平降低，去甲基化的P2X3R基因有利于p65的结合，进而促进P2X3R高表达。

　　类似的，Zhang等对大鼠 神经病理性疼痛模型的研究表明，支配后爪的DRG内DNMT3b表达明显降低，P2X3R基因启动子区CpG岛去甲基化，p65与P2X3R基因结合活性增强，引起DRG内P2X3R的高表达，参与 神经病理性疼痛的病理过程，阻断p65信号通路则能够缓解大鼠的痛敏症状。由此可知DRG内DNA甲基化修饰参与神经病理性疼痛的调控，但不同模型的诱发因素不同，机制可能不同，DNMTs的表达也有所不同。

　　神经病理性疼痛的另一个难题是阿片类药物的镇痛效果减弱。目前阿片类药物仍是应用最广的治疗神经病理性疼痛的药物，但长期应用不仅效果减弱，甚至可能产生严重的不良反应。Zhou等研究表明这可能与神经损伤引起的DRG内μ阿片受体(muopioidreceptor，MOR)下调有关，神经损伤可引起MOR基因近端启动子区甲基化水平升高，而给予DNA甲基化抑制剂后，DRG内MOR的表达升高，吗啡的镇痛效果也明显改善。这提示DNA甲基化抑制剂有望成为治疗神经病理性疼痛的辅助药物。

　　DRG接受外界环境刺激后，将信号转换并上传至脊髓或高级中枢进行信息整合。因此，脊髓也是神经病理性疼痛的重要调控位点。研究表明慢性坐骨神经压迫性损伤(chronicconstrictioninjury,CCI)后大鼠腰段脊髓背角谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase67,GAD67)的表达明显减少。

　　GAD67作为抑制性递质GABA合成的关键酶，其减少引起GABA抑制性作用减弱，参与神经病理性疼痛的形成。进一步研究表明GAD67基因启动子区甲基化水平升高，同时脊髓内DNMT3a、DNMT3b、甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpGbindingprotein2,MeCP2)表达升高，而甲基DNA结合域蛋白2(methylatedDNAbindingdomain,MBD2)含量下降。这提示外周神经损伤引起脊髓内GAD67的下调可能与DNMT3a、DNMT3b、MeCP2以及MBD2介导的GAD67基因启动子区DNA甲基化水平升高有关。

　　近年来，研究表明Wnt/fhcatenin信号通路也参与神经病理性疼痛的发生过程。Feng等研究表明CCI术后同侧脊髓背角内Wnt3a表达升高，同时Wnt3a基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平升高，胞嘧啶甲基化水平降低，提示组蛋白修饰和DNA甲基化共同调控基因表达。类似的，Wang等研究表明外周神经损伤后动物脊髓内总DNA甲基化水平以及MeCP2的表达明显升高，应用DNA甲基转移酶抑制剂后，脊髓内总的DNA甲基化水平和MeCP2的表达下降，同时神经损伤引起的动物痛觉敏感等症状也得到缓解。由此可知，脊髓内DNA甲基化修饰参与神经病理性疼痛的调控。

　　脑内前额叶皮质(prefrontalcortex，PFC)是调控疼痛的重要区域。Tajerian等研究表明坐骨神经分支损伤术后6个月，小鼠出现感觉异常和焦虑情绪，PFC和杏仁核内总DNA甲基化水平明显下降。而且，PFC内总DNA甲基化水平与动物痛敏症状的严重程度显著相关。通过环境富集化运动(environmentalenrichment)缓解神经损伤引起的动物痛敏症状后，PFC内总甲基化水平也有所回升。这提示DNA的甲基化可能是神经病理性疼痛与焦虑情绪的共同作用机制。实际上，大脑作为复杂的高级中枢，相关区域DNA甲基化参与多种生理过程。

　　Zhong等进一步探讨了神经病理性疼痛的亲代是否会对子代产生影响，研究显示神经病理性疼痛的母鼠普遍出现亲代照护缺陷，其喂养的子代表现出明显的焦虑情绪和行为，子代室上核后叶催产素表达下降，杏仁核内DNMT1高表达且总甲基化水平也明显升高。这提示脑内DNA甲基化不仅参与神经病理性疼痛的调控，也会对子代产生不良影响，但其具体机制尚未明确。

　　组蛋白的甲基化修饰与神经病理性疼痛组蛋白的甲基化修饰在神经病理性疼痛中同样发挥重要作用。Laumet等研究表明神经损伤后受损DRG内组蛋白赖氨酸N甲基转移酶2(G9a)的表达明显升高，同时多种膜电位相关钾离子通道基因启动子区H3K9me2水平升高，选择性基因敲除DRG内G9a的表达，不仅恢复了神经损伤引起的钾通道下调，也阻止了神经病理性疼痛的产生。进一步研究显示抑制DRG内G9a的表达也可影响神经损伤引起的许多其他基因的表达，MOR就是其中之一。研究显示神经损伤后受损DRG内MOR表达下调，其基因启动子区H3K9me2的含量增多，阿片类药物镇痛效果减弱;抑制或者敲减DRG内G9a的表达能够逆转MOR的下调并增强吗啡的镇痛效果;基因敲除DRG内G9a编码基因则能够阻止神经损伤所造成的上述改变。这提示DRG内G9a通过组蛋白甲基化修饰在神经病理性疼痛的形成和治疗中均发挥关键作用。

　　除G9a外，SUV39H1也是一种重要的组蛋白甲基转移酶，主要催化H3K9me3的形成。Zhang等研究表明脊神经结扎(spinalnerveligation，SNL)后受损DRG和同侧L5脊髓背角内SUV39H1的表达明显升高，阻断或敲减SUV39H1的表达能够缓解SNL引起的痛敏症状，这提示SUV39H1参与神经病理性疼痛的调控。但DRG和脊髓内SUV39H1的表达和作用机制不完全相同。DRG内SUV39H1的蛋白和mRNA均升高，提示转录和翻译水平均被激活，其参与调控神经病理性疼痛的机制与神经损伤引起的MOR的下调和脊髓中枢敏化有关;而脊髓内SUV39H1仅在翻译水平被激活，mRNA含量无明显变化，具体作用机制尚未明确。由此可知，组蛋白甲基化修饰可以在不同水平参与神经病理性疼痛，同一种受体也可由多种甲基化修饰酶来调控，而不同的调控通路似乎并不能相互补偿，阻断其中任一途径均可缓解神经病理性疼痛的症状。

　　此外，组蛋白甲基化修饰也可通过DRG和脊髓内其他信号通路参与神经病理性疼痛的调控，但目前脑内相关研究仍较少，这可能与大脑的复杂性有关。也有研究提示甲基化修饰可以通过调控免疫细胞和胶质细胞内的信号分子参与神经病理性疼痛的过程。

　　 3.甲基化修饰在临床上的应用

　　尽管多项动物研究提示甲基化修饰参与神经病理性疼痛的调控，但目前临床研究仍集中在疼痛现象与甲基化修饰的相关性方面，这可能与临床试验的复杂性有关。

　　Tajerian等研究显示慢性腰背痛患者体内细胞外基质蛋白SPARC(secretedprotein，acidic，richincysteine)表达下降，而SPARC基因启动子区的甲基化水平则增高，提示DNA的甲基化下调SPARC的表达。与同年龄段健康者比较，女性纤维肌痛症患者总甲基化水平明显升高。最近一项同卵双生子研究认为热痛域的下降与TRPA1基因启动子区DNA甲基化水平升高有关。SUkenaga研究表明慢性疼痛患者的疼痛症状与全血细胞中TRPA1的DNA甲基化状态相关。这些研究提示DNA甲基化可能成为某些疼痛疾病的生物标志物，我们可能通过检测甲基化水平评估疼痛症状及严重程度。

　　许多癌症患者可并发神经病理性疼痛。Viet等研究表明 癌患者MOR基因启动子区甲基化水平升高，对 癌模型动物应用去甲基化药物可产生镇痛作用，这可能由于癌细胞内MOR的再表达导致p-内啡肽分泌增多、神经元激活受抑制所致。最近一项I期临床研究评估了RRx-001在进展期癌症患者应用的安全性和耐受性。RRx-001在缺氧环境下可被激活，诱导产生活性氧和氮类物质，参与DNA甲基化、组蛋白乙酰化和赖氨酸去甲基化等表观遗传调控。该研究虽未直接探讨RRx-001的镇痛作用，但其在癌性神经病理性疼痛中的作用值得进一步探讨，同时也为表观遗传调控措施在临床上的应用提供了借鉴。

　　结合前文可知，甲基化干预措施通过阻断相关信号通路的传导，有可能作为镇痛药物或者辅助药物参与神经病理性疼痛的治疗。然而目前针对甲基化修饰的干预药物如DNMT抑制剂大多作为抗癌药物应用，对于非癌性痛患者的治疗仍待进一步研究。

　　由于神经病理性疼痛的机制非常复杂，加之临床标本收集相对困难，特别是组蛋白甲基化修饰特异性标本的取得更加困难，目前研究仍集中在动物模型中，要将动物实验结论转化为临床研究和应用，仍然任重道远。

　　 4.小结

　　甲基化修饰在神经病理性疼痛的发生发展中发挥重要作用。但目前研究中依然存在许多未解之谜：(1)甲基化修饰究竟是神经病理性疼痛产生的原因还是结果(2)甲基化修饰具体通过何种途径调控神经病理性疼痛?(3)甲基化修饰作为治疗神经病理性疼痛的干预措施时，如何才能保证特异性?总之，针对DNA和组蛋白甲基化修饰的研究使研究者对于神经病理性疼痛发病机制有了更深入的理解，也为新的诊疗方案提出提供了思路。

　　来源：临床麻醉学杂志2017年1月第33卷第1期