引言

2022年10月13日，复旦大学附属妇产科医院和博昊基因等单位牵头，在Cell Discovery1期刊上发表了其新一代NIPT的研究成果，通过创新性探针设计、无偏好的cfDNA等位基因靶向富集、RD(高通量测序reads深度)和AF(等位基因频率)数据同时分析染色体拷贝数和目标位点基因型的创新生信算法等，实现了对胎儿染色体非整倍体、染色体微缺失微重复和单基因遗传病的同步准确的无创产前检测。测序中国第一时间对该研究进行了解读报道。

新一代NIPT研究成果经过评审，受邀在洛杉矶举行的2022年美国人类遗传学协会(ASHG)年会进行口头汇报，这也是来自世界各地数千个参会者中被选中的50个摘要进行板报发言(Poster Talks)之一。ASHG年会是人类遗传学世界最高水平的学术会议。人类遗传学的分支领域较多，NIPT属于产前遗传学检测，在这个细分领域博昊基因作为唯一的代表被大会选中发言，体现了该研究工作受到了世界遗传学领域内同行的关注和认可。会后，来自于多个国家和地区的学者、医生对这项新的NIPT技术产生了很大兴趣，表示后续将与我们进行深入的国际科研和临床合作。

在经过几年的研发和临床研究，2019年在Nature Medicine2发表了一项新的NIPT技术，首次在临床上实现了对多种单基因疾病进行无创产前筛查。由于胎儿游离DNA只占母体血浆中游离DNA总量的一小部分，到妊娠中期平均也只占约10%，在部分样本里含量水平更低。因此文库构建或者测序过程当中引入的低比例的DNA变化会影响对胎儿突变的特异性辨别。正如文章报道，我们团队当时采用了液体活检里常用的分子标签技术加强了对真阳性和噪音之间的区别，取得了很好的检测效果。

单基因疾病进行无创产前筛查(NIPT-M)有显著的临床意义。对于软骨发育不全、努南综合征、Rett综合征等疾病，NIPT-M可以提前发现高风险妊娠提示产前诊断，通过分子检测发现早期发育无明显症状的遗传病患儿。但事实上，与更常见的染色体疾病相比，单基因疾病筛查仍存在市场教育不足的问题，包括临床服务的提供方和接受方。此外，目前染色体疾病与单基因疾病NIPT的分项检测提高了使用成本，进一步阻碍了NIPT-M的推广。因此，我回国以后着手开发新一代NIPT技术，旨在解决此前无法对染色体和单基因疾病同步分析的技术难点。

经过不懈努力，历经3年多的研发、测试、改进、临床实验，终于成功开发了协同等位基因靶向富集测序(COATE-seq)技术，实现对母胎游离DNA进行多维分析，解决了第一代NIPT的众多技术缺陷。在临床上，我们根据COATE-seq技术开发了NIPT2Pro这一项目，即近期发表文章中提到的针对多种染色体非整倍体、微缺失/重复、单基因疾病的同步无创产前筛查。与此前的工作相比，NIPT2 pro实现了高度均一地对目标染色体区域内单核苷酸多态性(SNPs)位点的野生型和突变型等位基因片段化DNA富集，产生高信噪比的游离DNA测序数据。此外，我们利用新的基因组算法来分析目标区域的测序深度、等位基因分数、连锁SNP，精确地分离胎儿基因组和母体背景。通过以上关键试剂、实验方法和生信算法的创新，我们实现了对包括多胎妊娠、母体拷贝数变异和杂合性丢失在内的分析干扰因素的准确识别，提高了对目标疾病的检测性能。此外，由于NIPT2 pro技术提升了对胎儿突变位点检测的灵敏性，首次在游离DNA中发现了非整倍体样本中存在的减数分裂重组异常，为进一步研究减数分裂不分离的机制提供了重要启示。

NIPT2 pro研发过程中，我们克服了种种意想不到的困难，因为采取的技术路径此前没有人尝试，所以得到的数据也是新的(比如我们首次检测到游离DNA中与减数分裂不分离相关的染色体重组异常)。由此产生的湿实验和干实验技术问题基本上没有可以用的参考资料，完全靠团队多年积累的医学遗传学理论知识和基因组学、分子生物学实验的经验来摸索规律，找到分析数据、解决具体问题的路径。在理清原理之后，要解决的就是技术问题了。在遗传学中，只要对相关原理理解透彻，有很多规律可以运用到具体数据分析的工作中，并取得可靠的实验结果。

博昊基因的好韵添和其它的NIPT-M技术相比，有什么特色、突破和创新?

博昊基因无创单基因病产品好韵添，是与NIPT2系列产品同步研发的。NIPT2 Pro除了检测胎儿常见染色体非整倍体、微缺失外，还覆盖了好韵添筛查的64个基因导致的92种常见高发单基因显性遗传病。因此，好韵添也使用了博昊基因专利的协同等位基因靶向富集测序(COATE-seq)技术。此外，与之前的工作不同，我们通过解析胎儿游离DNA片段长度，加强了胎儿单基因突变的特异性识别，提高了对胎儿单基因疾病进行无创产前筛查的检测准确性。好韵添针对新发的或者自父亲遗传的突变的分析灵敏度和分析特异度都接近或达到100%。

在研发过程中，好韵添检测的单基因病疾病数量远大于92种，但经过与临床结合，最终留下了64个基因导致的常见、高发和后果较严重的92种疾病，综合发病率约1/400。如再增加疾病，对筛查的临床意义十分有限。此外，对于单基因显性遗传病筛查，外显子和剪接区域全覆盖是非常重要的，不宜只检测固定位点。

与现有的方法学相比，NIPT2 Pro检测指标和检测性能如何?

博昊基因在完成了以COATE-seq为核心的技术研发后，与黄荷凤院士团队先后合作开展了NIPT2 Pro的回顾性和多中心前瞻性临床研究。方法学和回顾性临床研究成果已经在Cell Discovery发表。在入组的1129例妊娠样本中，NIPT2 Pro检测到54个胎儿非整倍体、8个MMS和8个单基因变异，灵敏度为100%，特异度为99.3%。

目前，NIPT2 Pro相关的一项历时2年的多中心前瞻性临床研究(针对多种类型遗传疾病的无创产前筛查的临床研究)也完成了病人入组、随访和数据分析。经过对1000余例高风险妊娠病例的随访和诊断结果对比，NIPT2 Pro主要检测性能指标均超过已上市产品或相关法规要求。由于采用的是基于靶向捕获的高深度测序，NIPT2 Pro对小片段染色体微缺失、性染色体异常等疾病检测性能有大幅度提升，这是第一代NIPT技术检测困难、准确度不高的疾病类型。例如，母体的性染色体拷贝数异常(包括嵌合突变携带者)是比较常见的NIPT干扰因素，由于其发生率相对较高，所以现有的NIPT技术对胎儿性染色体拷贝数异常，尤其是45X的检测阳性预测值不高。NIPT2 Pro采取了包括测序深度、基因型、连锁SNP和片段长度等多重信息对胎儿游离DNA进行特异性识别，能很好的区分胎儿与母体的X染色体片段特征，因此NIPT2 pro对性染色体异常检测的阳性预测值接近100%。

NIPT2Pro可以同步筛查115种胎儿常见高发遗传性疾病，含10种染色体非整倍体(除第一代NIPT的T21、T18、T13外3，还包括性染色体非整倍体等)、13种常见染色体微缺失综合征和92种单基因显性遗传病。13种常见染色体微缺失综合征是胎儿发病率较高、后果较为严重的综合征，覆盖了《基于孕妇外周血浆游离 DNA 高通量测序无创产前筛查胎儿基因组病技术标准》4内的所有染色体微缺失综合征。这13种微缺失综合征都有大量文献报道和数据库记录，是国内外广泛认可的产前筛查指标。

对于筛查类的遗传学检测而言，临床效用要综合考虑疾病的发病率和检测的准确度，而不是筛查疾病的绝对数量。相对而言，筛查几十种临床极为罕见的疾病，更重要的是对发病率很高的(如22q11.2缺失综合征，45X综合征等)常见疾病实现更准确的检测。对于增加同类疾病，基于NIPT2Pro的方法学主要是增加检测探针，然后验证即可。NIPT2 Pro目前覆盖的125个疾病，胎儿罹患率(孕妇普筛的真阳性率)测算大于1/200，具有很高的临床筛查效率。在保持高灵敏度的同时，NIPT2 Pro在降低染色体异常的假阳性率方面，还有了质的提升。

下一步，在NIPT方向还有哪些新的研究规划?

单基因隐性遗传病目前还没有可大规模应用的无创产前筛查手段，且许多高发且严重的单基因隐性遗传病是由具有高度同源序列的基因组区域的复杂变异引起的(如SMN1、HBA1/A2、CYP21A2等基因的变异)。我们可以利用NGS或长读长测序对这些复杂变异进行携带者筛查。然而，由于cfDNA的片段长度较短，这类变异目前尚不适合进行无创产前检测。此外，基于单体型的NIPT对隐性变异的检测也很有限，因为筛查项目通常无法在检测前获得父母的单体型信息。克服这一困难需要研发出无需先证者、无需父亲样本的针对单基因隐性遗传病的无创检测新技术。因此，在现有平台或新技术上平台上进行大量的创新研发工作，才可能开发出临床实用的、对重要隐性疾病检测性能较好的NIPT技术，这也是我们团队下一步工作的重点。总之，用一管孕妇外周血，更加准确高效地同步筛查出更多种类的胎儿重要遗传性疾病，是无创产前筛查发展的永恒追求，也是我们长期的研发目标。

科学的探索和技术的创新最后应用于临床服务不是一件容易的事情，尤其是涉及到新生命的产前临床技术。我认为一个成功的临床产品必须具有四方面特质：完备的科学理论基础、可靠的技术支撑、显著的临床效用和成熟的产品工业化水平。博昊基因经过四年多的成长，在NIPT产品与服务上取得了许多可喜的进展，获得了阶段性的成果，这与团队对产品倾注持续的专注力，不断超越自我、竭力锻造的工匠精神等是密不可分的。很荣幸能与这么优秀的团队一道朝着共同目标奋进，期望我们的技术更好地服务于广大用户。