刘思源，林亮 ，刘星

　　河北医科大学第三医院骨肿瘤科，石家庄， 050051

　　目的 以人成骨肉瘤细胞MG- 63为研究对象，探讨紫杉醇和吡柔比星诱导人成骨肉瘤细胞株MG-63凋亡的作用及其分子机制的比较，为骨肉瘤的治疗提供实验基础，寻找合理的药物配伍方法。

　　方法将MG-63细胞置于37℃，饱和湿度5％CO2的常规条件下培养，待细胞进入对数生长期后用于实验。

　　1 应用光镜观察细胞形态学变化 将不同浓度的紫杉醇和吡柔比星作用于MG-63细胞，在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并照相。

　　2 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度（10 、1×102、1×103、1×104nmol/L）紫杉醇和不同浓度（1×102、1×103、1×104、1×105nmol/L）吡柔比星对细胞的生长抑制作用。

　　3不同浓度紫杉醇和吡柔比星培养基作用24小时，对照组（不含药）、100nmol/L紫杉醇组和1×103nmol/L吡柔比星组培养基作用12h、24h、48h和72h收集细胞。收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液，3ml PBS洗一次。离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。500～1000r/min离心5min，弃去PBS。加入碘化丙锭（Propidium Iodide,PI 50mg/L Trinton X-100 1.0%）室温避光染色30min, 用Epics-XLⅡ型流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布，应用软件进行分析。

　　4 Western印迹法观察100nmol/L紫杉醇组和1×103nmol/L吡柔比星作用48小时后的人成骨肉瘤细胞MG-63的PCNA、cyclinD、cyclinE、Bcl-2、Bax、β-actin(内参)的表达。

　　结果（1）倒置相差显微镜下观察可见经100nmol/L紫杉醇处理MG-63细胞12h后，细胞折光变强，部分细胞体积变小变圆，24h后细胞开始皱缩，贴壁能力差，细胞体积更小，少量细胞漂浮，48h后细胞体积普遍变小，保质浓缩，大量细胞变圆漂浮，72h后大部分细胞细胞漂浮，变化更加明显。1×103nmol/L吡柔比星组培养基作用12h后细胞增值数量减少少量细胞体积增大胞膜破裂保质外溢，细胞坏死漂浮，24h后分裂期细胞少见，胞膜破裂细胞坏死，漂浮细胞增多，48h后大部分细胞形态不规则，体积增大，坏死漂浮，存活细胞颜色晦暗，生长停滞，72h后漂浮坏死细胞明显增多。（2）不同浓度（10 、1×102、1×103、1×104nmol/L）紫杉醇和不同浓度（1×102、1×103、1×104、1×105nmol/L）吡柔比星作用于MG-63细胞12h/24、48、72h，MTT结果显示紫杉醇和吡柔比星均能明显抑制MG-63细胞增殖，并呈剂量和时间依赖性（p<0.01）。（3）FCM分析发现，不同浓度（1、10 、1×102、1×103、1×104nmol/L）紫杉醇处理细胞24h及100nmol/L紫杉醇处理细胞12h、24h、48h、72h后，G0/G1期前面出现凋亡峰，G2/M期所占比例随药物浓度和时间增加呈上升趋势，而G1期所占比例呈递减趋势。不同浓度（10、1×102、1×103、1×104、1×105nmol/L）吡柔比星处理细胞24h及1×103nmol/L吡柔比星处理细胞12h、24h、48h、72h后未见明显凋亡峰出现，S期所占比例随药物浓度和作用时间增加呈上升趋势。（4）western-bloting结果 经紫杉醇和吡柔比星处理过的骨肉瘤细胞与对照组相比均表现出PCNA、cyclinD、cyclinE和Bcl-2蛋白表达抑制，Bax蛋白表达增强。

　　结论（1）紫杉醇和吡柔比星均对骨肉瘤细胞MG-63存在抑制细胞增殖作用且具有时间-剂量依赖关系。（2）紫杉醇对骨肉瘤细胞MG-63显示出G2/M阻滞作用，并且有一定的时间-剂量依赖性，使细胞周期受到阻滞，并进一步诱导其凋亡。吡柔比星在细胞增殖周期中阻断细胞进入G2期，使细胞停滞于S期，抑制DNA合成干扰细胞分裂。在一定范围内存在时间-剂量依赖性且对剂量关系更密切。（3）吡柔比星还可能通过破坏骨肉瘤细胞MG-63细胞膜的结构和功能直接杀死细胞。（4）紫杉醇可与吡柔比星联合应用治疗骨肉瘤。

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