背景：足细胞是肾小球内终末分化的上皮细胞，在超滤过程中起着重要作用。肾小球滤过屏障(GFB)功能障碍通常归因于足细胞损伤。足细胞代谢活跃，需要大量的能量供应，有证据表明线粒体功能障碍与足细胞病变之间存在相关性。尽管足细胞最初被认为仅仅是肾小球的结构成分，但最近发现它们具有对肾小球来源的和系统循环的激素和其他体液因子作出反应的机制。甲状腺激素是一种循环的碘化信号分子，在几乎所有细胞中调节生理和发育过程。支持这一点的是，肾脏中TH调节失调与肾小球疾病和其他肾脏并发症有关。甲亢与肾脏血流和吸收能力增加有关，而甲减则与肾小球基底膜(GBM)增厚和滤过率降低有关，这表明甲状腺的正常功能和肾脏的健康之间存在明显的重叠。此外，Graves病(一种自身免疫性甲亢形式，其特征是存在针对促甲状腺激素受体(TSH-R)的甲状腺刺激性自身抗体，导致受体激活，表现为伴有肾病综合征(NS)的膜性肾小球肾炎，也有一些零星的膜增生性肾小球肾炎或微小病变疾病的报道。另一方面，甲状腺功能减退与NS有关，但只是由于TH尿量增加而导致的次要结果。由于NS与甲状腺功能亢进症的主要结局更为密切相关，本研究的目的是明确足细胞是否以及如何对T3输入做出反应并调节T3输入，而足细胞的生物活性T细胞则被认为是甲状腺功能亢进症(甲亢)的主要结果。因此，本研究旨在确定足细胞是否以及如何对生物活性甲状腺激素(TH)3,5,3’三碘甲状腺原氨酸(T3)的输入进行反应和调节;也旨在破译3型脱碘酶(D3)在肾脏疾病中的病理生理作用。D3是一种膜结合的硒酶，可使TH失活。

方法：采用免疫荧光、qPCR和足细胞特异性D3基因敲除的方法，研究正常和损伤足细胞(PAN、嘌呤霉素氨基核苷和LPS、脂多糖介导的)D3的功能。采用表面等离子体共振(SPR)、免疫共沉淀和邻近连接分析(PLA)等方法进行相互作用研究。

免疫荧光：将小鼠或人足细胞以20GB103cells/ml的浓度接种到玻璃片(Marienfeld)的12孔板中，并允许如上所述进行分化。细胞用冰冷PBS冲洗，室温下用4%PFA固定10min，再用0.1%TritonX-100通透5min。盖玻片用PBS清洗2次，每次5min后，用5%驴血清(Sigma-Aldrich，D9663)封闭缓冲液室温孵育1h。免疫荧光染色：细胞与定制的兔抗人D3(1：100;NovusBiologics，NBP1-05767;RRID：AB_1556282)和/或鼠抗人突触素(1：300;D-9;SantaCruzBiotechnology，sc-515842)在4°C孵育过夜。细胞用冷PBS洗涤，与适当AlexaFluor488标记的驴抗兔IgG(1：1000;分子探针A-21206;RRID：AB_2535792)和/或AlexaFluor647标记的驴抗鼠IgG(1：1000;分子探针A-31571;RRID：AB_162542)在室温下孵育1h，细胞在PBS中用0.1mg/mlDAPI(Invitgen，D1306)染色。然后用Zen软件(Zeiss)用LSM700激光扫描荧光共聚焦显微镜观察细胞。

逆转录定量聚合酶链式反应(QPCR)检测：根据制造商的说明，使用Trizol试剂(Invitgen)或RNAasyMiniKit(Qiagen)从生长在三个独立孔(生物复制)中的培养细胞中提取总RNA。用分光光度法测定260nm(A260)和280nm(A280)的吸光度，并使用NanoDrop2000分光光度计(ThermoFisherScience)评估A260/A280比值，从而确定RNA的浓度和质量。小鼠甲状腺总RNA购自TakaraBio(#636674)。按照标准方法(应用生物系统，4368813)使用高容量cDNA逆转录试剂盒合成cDNA，并将其保存在-20°C下，直到进一步使用。使用CFX96实时系统热循环仪(Bio-Rad)进行PCR反应，一式三份(技术复制)。用2DDCt法将结果用归一化为gapdhmRNA水平的基因表达水平表示为折叠变化，以Dio2作为计算折叠变化的参考基因。以下TaqMan基因探针购自ThermoFisherScience：小鼠Dio1(Mm00839358_M1)、小鼠Dio2(Mm00515664_M1)、小鼠Dio3(Mm00548953_S1)、小鼠Gapdh(Mn99999915_G1)、人Dio3(Hs00956431_S1)、人GAPDH(Hs02758991_G1)、小鼠PGC-1a(Mm01208835_M1)、鼠标Hr(Mm00498963_M1)和鼠标Tshr(Mm00442027_M1)。

足细胞特异性D3基因敲除(D3KO)小鼠模型的建立：利用成熟的Cre-loxP技术，我们选择性地灭活了成人肾小球足细胞中的D3。纯合子小鼠(Dio3fl/fl)命名为D3-Flox，由多梅尼科·塞尔瓦托(那不勒斯大学公共卫生系，意大利那不勒斯，费德里科二世)[20]实验室培育，由芝加哥大学医学系AntonioBianco慷慨捐赠。D3的催化区含有硒半胱氨酸残基，由框内UGA终止密码子编码。然而，为了覆盖终止密码子而插入硒半胱氨酸，在mRNA的30UTR中需要一个被称为硒半胱氨酸插入序列(SECIS)的顺式作用茎环序列(SECIS)。由于SECIS元件是D3蛋白全长翻译所必需的，因此该区域在Dio3基因中被去除。为了实现这一点，我们构建了一个含有Dio3位点上漂浮位点的质粒，该质粒位于Dio3mRNA中位于ATG的1,001和1,706个核苷酸的SECISmRNA结构的两侧。在没有SECIS的情况下，D3催化域内的TGA密码子将被识别为终止密码子，蛋白质翻译将终止[20]。我们将这些D3Flox小鼠与足细胞特异性Nphs2启动子下表达Cre重组酶的驱动鼠品系(Pod-Cre小鼠)(取自Jackson实验室)杂交，产生D3KO小鼠(Pod-Cre+/Flox：：Dio3flx/Flox)。所有小鼠均以纯C57BL/6J(B6)为背景。在Pod-Cre转基因存在的情况下，D3KO小鼠将有足细胞特异性地切除花状dio3SECI，导致空等位基因终止于UGA密码子，没有D3催化活性。Podocin-Cre仔猪作为对照。用CflipU和FflipL引物确定lox位点，用pod-cre-f和pod-cre-r引物确定cre位点，证实了预期的重组事件发生在后代中。为了进一步证实D3KO小鼠足细胞中缺乏D3的表达，从10周龄D3KO小鼠的肾小球或产仔对照鼠肾小球中分离出原代足细胞，如下2.7节所述。用兔抗D3抗体(10mg/ml，NovusBiologics#NBP1-05767)进行Westernblot分析，用ImageJ软件计算D3带的相对密度，归一化为GAPDH，并与窝产仔对照组(每组3只)进行比较。

结果：健康足细胞表达D3作为主要的脱碘酶亚型。足细胞损伤后，无论是在体外还是在LPS小鼠足细胞损伤模型中，Dio3转录和D3蛋白的水平都显著降低。D3不再定位于细胞膜，而是聚集在高尔基体和细胞核中。此外，耗尽小鼠足细胞中的D3会导致足突消失和蛋白尿。小鼠足细胞经T3处理后，D3缺失，Avb3整合素信号被激活，导致足细胞损伤。我们还证实了小鼠足细胞上存在活性促甲状腺激素受体(TSH-R)，这种受体的参与和激活会导致足细胞损伤。

结论：这项研究为D3-αvβ3整合素相互作用如何使T3依赖的整合素激活最小化提供了证据，说明了D3如何在足细胞中扮演肾保护性甲状腺激素的角色。此外，在Graves病患者中发现的TSH-R与TSH-R抗体结合造成的损伤，解释了甲状腺疾病和NS之间可能存在的联系。