氧化应激对人视网膜色素上皮细胞屏障功能的影响及其分子机制研究
近日，西安交通大学医学院第二附属医院眼科柏凌、闫欢欢、张德秀等共同发表文章，旨在观察氧化应激对人视网膜色素上皮(RPE)细胞紧密连接屏障功能及紧密连接蛋白occludin、claudin-1 ～4表达水平的影响。研究表明，氧化应激能够破坏RPE紧密连接的完整性，使其屏障功能受损，而claudin-1～4的表达水平变化可能在RPE的氧化损伤中发挥重要的作用。该文发表在《中华眼科杂志》2012 年第48卷第5期上。
近日，西安交通大学医学院第二附属医院眼科柏凌、闫欢欢、张德秀等共同发表文章，旨在观察氧化应激对人视网膜色素上皮(RPE)细胞紧密连接屏障功能及紧密连接蛋白occludin、claudin-1 ～4表达水平的影响。研究表明，氧化应激能够破坏RPE紧密连接的完整性，使其屏障功能受损，而claudin-1～4的表达水平变化可能在RPE的氧化损伤中发挥重要的作用。该文发表在《中华眼科杂志》2012 年第48卷第5期上。
该研究培养人RPE细胞株D407，分为H202处理组和H2O2未处理组(对照组)。MTT法观察不同浓度H2O2对D407细胞活性的影响；分别应用经上皮电阻(TER)和荧光素钠渗透实验检测低浓度H2O2作用24h和72 h后RPE紧密连接屏障功能的变化；通过实时荧光定量PCR法和免疫印迹法分别从mRNA和蛋白水平检测H2O2作用24h后对紧密连接蛋白occludin 、claudin-1 ～4表达水平的影响。采用t检验统计分析TER、荧光素钠渗透实验、实时荧光定量PCR法、免疫印迹法的检测结果，采用单因素方差分析统计分析细胞活力结果。
结果显示，H2O2≤0.4 mmol/L时，处理24h对RPE细胞的活力无明显影响。选择0.2 mmol/L为后序试验的浓度。D407细胞培养8d后，TER达到稳定状态。0.2 mmol/L H2O2作用3h后TER开始下降，至12 h出现明显差异(18.62±1.89比24.11±0.96，t=4.490，P=0.013)，24h接近最大效应(11.86±1.19比24.13±1.26，t=12.260，P=0.000)，维持至72 h(11.56±1.47比24.33±1.52，t=10.460，p=0.000)。H2O2处理D407细胞24 h后加入荧光素钠，不同时间点处理组的荧光渗透百分比均高于对照组(20 min：25％±3％比12％±4％，t=-4.50，P=0.011；40 min：36％±4％比16％±5％，t=-5.41，P=0.006；60 min：51％±5％比29％±6％，t=-4.88，P=0.008)。H2O2处理D407细胞24h后，claudin-1、3、4的mRNA和蛋白表达水平较对照组下调(claudin-1 mRNA：0.98±0.18比0.28±0.12，t=5.60，P=0.005，claudin-1蛋白：48±10比100±12，t =5.77，P=0.004；claudin-3mRNA：0.37±0.12比1.03±0.15，t =5.95，P=0.004，claudin-3蛋白：63±13比100±15，t=3.23，P =0.032：claudin-4 mRNA：0.38±0.11比0.99±0.17，t=5.22，P=0.002，claudin-4蛋白：57±12比100±13，t=4.21，P=0.014)，claudin-2 mRNA和蛋白表达水平则较对照组明显上调(mRNA：1.01±0.22比3.96±0.24，t=-15.69，P=0.000，蛋白：195±15比100±13，t=-8.29，P=0.001)，但occludin的mRNA和蛋白表达水平在处理组和对照组的差异均无统计学意义(mRNA：1.30±0.21比1.02±0.16，t=-1.84，P=0.140，蛋白：109±15比100±14，t=-0.76，p=0.490)。
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