慢性心衰患者尿液双向凝胶电泳技术的优化
目的 建立并优化慢性心衰尿液双向电泳技术以提高其分辨率及重复性。方法 收取尿液标本后，采用超滤法富集并浓缩尿液蛋白，Bradford法测浓度后进行双向电泳；第一向为等电聚焦，第二向为SDS-PAGE胶；凝胶经银染显色后，用Melanie 4软件分析2-DE图谱。分别对上样量，聚焦参数等步骤进行优化。
目的 建立并优化慢性心衰尿液双向电泳技术以提高其分辨率及重复性。
方法 收取尿液标本后，采用超滤法富集并浓缩尿液蛋白，Bradford法测浓度后进行双向电泳；第一向为等电聚焦，第二向为SDS-PAGE胶；凝胶经银染显色后，用Melanie 4软件分析2-DE图谱。分别对上样量，聚焦参数等步骤进行优化。
结果 (1)不同上样量对2-DE图谱的影响:为了比较不同上样量对尿液2-DE的影响，探索更合理的上样量；我们分别进行了150μg（IPG pH3-10NL，24 cm）和250μg（IPG pH3-10NL，24 cm）两组上样量的比较。图1A上样量为250μg，图谱上有些蛋白点过饱和，许多蛋白质点融合在一起；掩盖附近一些低丰度蛋白的表达，使其分辨率降低,且其图染色背景较深。图1B上样量为150μg，尽管蛋白上样量较图1A少，但整个图谱效果明显好于图1A，虽然出现的蛋白点要少于前图，但大部分蛋白质点能够清晰分辨，背景较为清晰，以便进行后续的差异点的辨认和鉴定等后续实验。因此后续实验我们的上样量一般为150μg。
(2)不同聚焦参数对2-DE图谱的影响: 如果聚焦伏特数不够，蛋白就有可能到达不了相应的等电点部位，一方面出现的蛋白点较少，另一方面会在2-D图谱上出现横条纹：反之如果聚焦过度，蛋白就会在等电点附近发生沉淀，同样也会在2-D图谱上出现横条纹。为了获取理想的蛋白图谱，我们在实验过程中不断比较了50 KVh/60 KVh两组实验，即聚焦程序：100V 1h, 500 V 1h, 1000 V 1h, 8 000 V 3h, 8 000 V 50/60 KVh，500 V 3h。结果发现聚焦总伏特数50 KVh组相应的蛋白图谱的蛋白点少，横条纹较多（图2A），系聚焦不够，部分蛋白没有到达相应的等电点所致；而对比之下聚焦总伏特数60 KVh组的2-D图谱上不仅蛋白点较多，而且横条纹也大大减少（图2B），分离效果较好。因此我们认为60 KVh对于尿液蛋白是聚焦适度的。
结论 建立稳定性高，重复性好的慢性心衰尿液双向凝胶电泳技术，从蛋白组水平研究慢性心衰奠定了基础。
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