【摘要】  目的  研究肝脏合成的促抗凝因子、纤维蛋白原降解产物、肝外组织合成的凝血相关蛋白等成分在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭患者中的变化特点，探讨肝脏疾病凝血与出血之间的平衡关系，寻找肝病初期的敏感指标。方法  收集我院慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭患者、健康者资料，并分为慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝衰竭组，正常对照组。用真空管抽取患者肘静脉血2.7ml，真空管内含109 mmol/L的枸橼酸钠抗凝剂，其与血液的比例为1∶9。取血后1 h内3000 ×g离心15min，分装冻存于-70 ℃。凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性检测用一期凝固法检测；凝血象活化部分凝血酶原时间、凝血酶时间、凝血酶原时间、纤维蛋白原用凝固法检测；蛋白质C、AT-Ⅲ用发色底物法检测；纤维蛋白原降解产物（FDP）、D-二聚体（D-D）浓度检测用免疫比浊法；组织因子途径抑制物（TFPI）、血栓调节蛋白（TM）、血管性血友病因子（vWF）及组织因子（TF）含量测定用酶联免疫吸附法。数据均进行正态性及方差齐性检验。不同程度的肝脏疾病之间用方差分析，并进行组间的多重比较及非参数秩和检验。结果  肝硬化组患者20例；慢性乙型肝炎组患者10例；肝衰竭组患者18例,正常对照组10例。除凝血因子Ⅷ外，由肝实质细胞合成的凝血因子、抗凝蛋白活性均降低；凝血象延长，FDP，D-D含量升高，TFPI、TM、vWF及TF检测值在慢性乙型肝炎组开始升高，至肝衰竭组明显升高。TFPI∶Ag检测值（慢性乙型肝炎组：239.3 ±206.4；肝硬化组：315.0 ±258.6；肝衰竭组：319.5 ±298.1；均高于正常对照组的104.0 ±87.1；F = 5.453，P< 0.05）；vWF∶Ag检测值（慢性乙型肝炎组：70.3 ±29.5；肝硬化组：105.5 ±57.9；肝衰竭组：179.3 ±61.7；均高于正常对照组的21.9 ±7.2；F = 20.104，P < 0.05）；TF检测值（慢性乙型肝炎组：86.0 ±85.7；肝硬化组：234.2 ±202.9；肝衰竭组：344.7 ±214.6；均高于正常对照组的12.9 ±8.1；F = 8.619，P < 0.05）；FⅧ∶C检测值（慢性乙型肝炎组：157.2 ±53.4；肝硬化组：206.9±86.9；肝衰竭组：335.7 ±117.7；均高于正常对照组的105.5 ±46.2；F = 13.418，P< 0.05）。结论  肝脏疾病随着病情发展，由肝实质细胞合成的促抗凝成分伴发平行减少、纤溶活性增强、肝外合成凝血相关蛋白TFPI、TM、vWF及TF释放入血增多。终末期肝病患者凝血与抗凝平衡失调，可能与以上原因有关。TFPI、TM、vWF及TF在肝病轻度阶段即发生明显变化，可作为早期监测血管内皮细胞损伤敏感指标。

【关键词】   肝炎，乙型，慢性；   肝功能衰竭;   凝血因子

Changing characteristic of blood coagulation factors and their correlation with blood coagulation status in different hepatic diseases   CHEN Jing, DUAN Zhong-ping, BAI Li, ZHAO Jun, DING Mei, TONG Xin-yuan, CONG Yu-long. Clinical Laboratory, the PLA General Hospital, Beijing, 100853, China\

Corresponding author: CONG Yu-long, Email: yulongc@263.net

【Abstract】  Objective    To investigate the correlation between procoagulation factors and anti-coagulation factors synthesized by the liver, and the correlation between fibrin degradation products (FDP) and D-dimer (D-D) concentration and coagulation proteins synthesized by extra-hepatic tissues, in different liver diseases; to explore the relationship between coagulation and bleeding in hepatic diseases.  Methods  Chronic hepatitis B (CHB) patients, CHB-related liver cirrhosis patients, CHB-related liver failure patients and healthy (normal) controls were selected for study and provided blood samples for analysis. The activity of coagulation factors (F) II, V, VII, VIII, IX, X, XI, and XII was detected using the one-stage clotting method. Coagulogram analysis, including activated partial thromboplastia time (APTT), thrombin time (TT), and prothrombin time (PT), was conducted by the solidification method. Antithrombin III (AT-III) and protein C (PC) activities were measured by chromogenic substrate assay. FDP concentration was detected using immunoturbidimetry. Tissue factor pathway inhibitor (TFPI), thrombomodulin (TM), von Willebrand factor (vWF), and tissue factor (TF) concentrations were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results  With the exception of FVIII, coagulation factors and anticoagulant proteins synthesized by the liver were decreased and the coagulogram was extended for all patients. Likewise, the FDP and D-D concentrations were increased in blood. CHB patients, however, presented with increased levels of FVIII, TFPI, TM, vWF, and TF. Pairwise comparison indicated statistical differences existed among CHB, CHB-realted liver cirrhosis, and liver failure patients: TFPI: 239.3 ± 206.4, 315.0 ± 258.6, and 319.5 ± 298.1 — higher than normal control: 104.0 ± 87.1, F = 5.453, P < 0.05; vWF: 70.3 ± 29.5, 105.5 ± 58.0, and 179.3 ± 61.7 — higher than normal control: 21.9 ± 7.2, F = 20.104, P < 0.05; TF: 85.9 ± 85.7, 234.2 ± 202.9, and 344.7 ± 214.6 — higher than normal control: 12.8 ± 8.1, F = 8.619, P < 0.05; FVIII: 157.2 ± 53.4, 206.9 ± 86.9, and 335.7 ± 117.7 — higher than normal control: 105.5 ± 46.2, F = 13.418, P < 0.05. Conclusion  In parallel to the progression of liver diseases, procoagulation and anti-coagulation elements synthesized by the liver were reduced. In contrast, fibrinolysis activity was enhanced, which is expected to lead to an imbalance between blood clotting and anti-clotting factors. This may be an important cause for the bleeding that occurs in end-stage liver disease. Expressions of TFPI, TM, vWF, and TF significantly change in the early stage of liver diseases, as compared to normal (healthy) levels, and may represent a sensitive indicator of vascular injury.

【Key words】    Hepatitis B, chronic;    Liver failure;    Coagulation factors

我们选择慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭3种不同类型的肝病患者作为研究对象，从不同肝病之间、同种肝病不同发展阶段之间以及与正常对照人群比较，观察分析其变化规律，现报道如下。

材料与方法

1. 病例选择：肝硬化、慢性乙型肝炎诊断标准根据2000年《病毒性肝炎防治方案》[1]；乙型肝炎慢性肝衰竭诊断标准参照《肝衰竭诊疗指南》[2]。并分为慢性乙型肝炎组、肝硬化组、肝衰竭组，收集健康人相应资料作为正常对照组。

2. 选择病例排除标准：排除已知使用干扰血凝药物的患者或细菌感染、肝细胞癌、肝外恶性肿瘤患者或已知有凝血障碍的患者。

3. 实验室分析样本的留取：凌晨5点用真空管抽取各组成员肘静脉血2.7 ml，真空管内含109 mmol/L的枸橼酸钠抗凝剂，其与血液的比例为1∶9。取血后1 h内3000 ×g离心15 min，分装冻存于-70℃，待用。

4. 检测方法：（1）凝血因子（F）促凝活性检测：凝血因子Ⅱ凝血活性（FⅡ∶C）、FⅤ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C均用一期凝固法检测，试剂购自德国Simens公司；（2）活化部分凝血酶时间（APTT）测定、凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原（Fig）用凝固法检测，仪器购自美国Backman公司，试剂与仪器配套；（3）蛋白质C、AT-Ⅲ用发色底物法检测，仪器购自法国Stago公司，试剂与仪器配套；（4）纤维蛋白原降解产物（FDP）用免疫比浊法，仪器购自法国Stago公司；D-二聚体含量检测用免疫比浊法，试剂盒购自法国Diagnostic Stago公司；全自动血凝仪购自法国Stago公司；（5）血小板计数用电阻抗法，仪器购自日本Sysmex公司；（6）肝外合成蛋白组织因子途径抑制物（TFPI），组织因子（TF），血栓调节蛋白（TM），血栓性血友病因子（vWF）含量测定用酶联免疫吸附法，试剂购自上海太阳生物公司，检测吸光度（A）值所用的仪器购自芬兰Thermo electron corporation公司。

5. 统计学方法：所有数据用CHISS统计软件进行处理分析。计量资料以均数±标准差(x ±s）表示，数据均进行正态性及方差齐性检验。不同程度的肝脏疾病之间用方差分析，并进行组间的多重比较及非参数秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结    果

1.    一般情况：肝病患者均为住院患者，其中男患者37例，女患者11例，平均年龄43岁，范围为20～66岁。48例患者中肝衰竭18例，肝硬化20例（肝硬化代偿期5例，肝硬化失代偿期15例），慢性乙型肝炎10例（慢性乙型肝炎中度5例，慢性乙型肝炎重度5例）。48例患者均经过临床、实验室和超声诊断确诊。共收集10例健康成人资料作为正常对照组。

2. 凝血因子在不同类型肝病中的变化：慢性乙型肝炎阶段凝血因子Ⅱ和Ⅶ变化较明显，在肝衰竭中因子Ⅱ和Ⅶ较其他因子变化显著，见表1。

3. 抗凝蛋白和纤溶降解产物在不同类型肝病中的变化：蛋白质C∶A和AT-Ⅲ∶A在3种不同类型肝病中差异有统计学意义，纤维蛋白原降解产物和D-二聚体则随着病情的进展含量升高，见表2。

4. 凝血象与血小板在不同类型肝病中的变化：TT在肝衰竭与肝硬化的比较虽然存在差异，但在肝衰竭中的24.3 s没有超出正常参考范围的上限27 s，见表3。

5. 凝血因子在肝硬化代偿期和失代偿期中的比较结果：在肝硬化代偿期阶段，以凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅻ活性降低最明显, 低于参考范围的下限70%；尤以凝血因子Ⅱ、Ⅹ为著，见表4。

6. 凝血因子在慢性乙型肝炎重度和中度中的检测结果：FⅧ∶C在慢性乙型肝炎中度即出现升高，提示此阶段可能已有血管内皮细胞的损伤，FⅡ∶C和FⅩ∶C在慢性乙型肝炎重度阶段下降较之其他凝血因子明显，提示在病变轻度阶段敏感的凝血因子为FⅡ和FⅩ,见表5。

7. 肝外合成5种检测指标在肝硬化代偿期和失代偿期中的检测结果：FⅧ∶C和TFPI∶Ag在肝硬化失代偿期较之代偿期有明显升高；其他3个指标变化差异无统计学意义，见表6。

8. 肝外合成5种指标在3种不同类型肝病中的分析：FⅧ∶C在慢性乙型肝炎阶段即开始升高；2、TFPI∶Ag在3种不同类型的肝病中差异无统计学意义；TM∶Ag在3种不同的肝病中变化差异无统计学意义，见表7。

讨    论

本研究结果显示，各指标检测结果在3种不同类型的肝病中均有不同程度的改变。凝血因子由肝细胞合成分泌入血，且各指标值随着病情的加重而减少。在慢性乙型肝炎阶段即有明显变化的是FⅡ和FⅩ,而非FⅤ和FⅦ。说明在肝病的轻度阶段FⅡ和FⅩ的变化最为敏感。FⅡ和FⅩ在整个凝血过程中的作用非常关键，一个是形成有效的凝血块所必需，一个是内外源性凝血途径中的共同因子，这两个因子的减少则直接影响着凝血酶的形成。各指标在慢性乙型肝炎与正常对照的比较中差异无统计学意义，则说明在肝病轻度阶段，由于肝细胞损伤较轻，对表1中凝血因子的8个指标无影响或影响较小。抗凝蛋白和纤维溶降解产物在不同类型肝病中的变化结果显示终末期肝病患者纤溶活性增强。凝血象与血小板在不同类型肝病中的变化结果显示，从病情的进展考虑，PT、APTT、TT 3项应随着病情的加重延长，且应与表1中凝血因子的变化趋势一致。但对PT、APTT、TT3个指标在肝硬化、慢性乙型肝炎与正常对照及慢性乙型肝炎与肝硬化的两两比较中差异无统计学意义，提示在慢性乙型肝炎和肝硬化阶段，PT、APTT、TT不能敏感反映出其对应凝血因子的变化，与表1中凝血因子的变化不一致。

FⅧ、TF、TFPI、TM、vWF 5个指标为肝外合成蛋白，由血管内皮细胞合成。肝脏疾病往往伴有血管内皮损伤致5种蛋白释放入血增加，血浆浓度升高。与其他由肝细胞合成的促凝血因子不同，在肝脏疾病中，FⅧ的血浆水平是升高的。FⅧ的基因表达主要在肝窦内皮细胞，此结果可以解释肝脏疾病时由肝细胞合成的凝血因子与肝窦内皮细胞合成的FⅧ在血浆水平上的不同。其次，FⅧ活性升高也可能与蛋白质C活性显著降低有关。FⅧ活性在慢性乙型肝炎中度和重度阶段有轻微的升高，提示在肝病轻度阶段即有血管内皮的损伤。vWF为调节FⅧ血浆浓度的重要因子，由血管内皮细胞合成。vWF结合FⅧ并保护FⅧ免受蛋白水解和成熟前的剪切。在肝病组织中，vWF伴发FⅧ共表达有助于调节血浆FⅧ水平。

TFPI为外源性凝血途径产生的天然抑制剂。通过FⅩa依赖的方式与因子Ⅶa、Ⅹa和TF形成四元复合物，抑制外源性凝血途径达到抗凝的作用。有研究结果显示在肝硬化中TFPI的水平降低，晚期肝细胞疾病中，TFPI水平正常[3]。此报道与本研究结果不一致。但本研究结果显示在3种不同的肝病中两两比较其升高程度没有明显的不同，考虑可能原因：（1）TFPI对血管内皮的损伤较敏感，在慢性乙型肝炎即开始升高，随着病情的加重其血浆水平升高明显。至疾病终末期随着血管内皮损伤进一步加重，TFPI与TF结合耗竭，使TFPI血浆水平显著降低。但是，此结果存在研究缺陷，即本研究所有数据均为平均值，不能很好的反应个例的真实情况。个例之间TFPI水平有明显差异，用均值代表一个病种进行研究掩盖了个例的真实变化情况。（2）可能与标本的选择有关，TFPI平均值后面的标准差过高，造成样本间离散程度太大导致结果的不可比性。TF为外源性凝血途径主要启动子[4]。从数据上分析，TF在肝硬化与肝衰竭、慢性乙型肝炎与肝硬化、慢性乙型肝炎与正常对照的比较，差异无统计学意义，提示肝硬化阶段组织及血管受损严重致TF大量释放入血。TF释放入血的量在肝硬化代偿期达到一个峰值，至肝衰竭阶段趋于平缓，造成肝硬化代偿期与失代偿期和肝硬化与肝衰竭之间的比较没有明显不同。

TM的抗凝功能通过与凝血酶和蛋白质C相互作用而介导。由于大量的TM存在于微血管系统，外周产生的绝大多数凝血酶被释放入血的TM抑制，此或许可以解释为什么在慢性乙型肝炎重度即可以出现凝血酶（凝血因子Ⅱ）的明显变化，而并非是文献报道的FⅤ和FⅦ。TM在3种不同类型肝病中的两两比较差异无统计学意义，但3种不同类型的肝病与正常对照相比，差异却有统计学意义，说明TM在慢性乙型肝炎即发生变化，但并不随着疾病的加重而显著增高，具有浓度相对稳定性特点。

本次研究的5个指标为较为敏感的肝外合成蛋白，且在肝病的轻度阶段（慢性乙型肝炎）即开始升高，可反映肝脏疾病时血管内皮损伤的情况。5个指标都与凝血相关，FⅧ、TF虽为促凝因子，但分别被vWF、TFPI结合使其促凝血活性受到了一定的抑制。TM释放入血，通过结合凝血酶而抑制其活性，又可通过TM-凝血酶复合物激活蛋白质C，进而灭活FⅤa、FⅧa进一步加重抗凝作用。另外，TFPI和TM在慢性乙型肝炎阶段即释放入血，分别抑制FⅦa、FⅩa和FⅡa，给出了为何肝病轻度阶段即有FⅡa和FⅩa的降低，以及终末期肝病FⅦa降低程度远高于其他凝血因子的理论依据。

参  考  文  献

[1]   Chinese Society of Infectious Diseases and Parasitology and Chinese Society of Hepatology of Chinese Medical Association. The programme of prevention and cure for viral hepatitis. Chin J Hepatol, 2000, 8 : 324-329. (in Chinese)

       中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会．病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志, 2000, 8: 324-329．

[2]   Liver Failure and Artificial Liver Group, Chinese Society of Infectious Diseases, Chinese Medical Association; Severe Liver Diseases and Artificial Liver Group, Chinese Society of Hepatology, Chinese Medical Association. Diagnostic and treatment guidelines for liver failure. Chin J Hepatol, 2006, 14: 643-646. (in Chinese)

       中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组、中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组.肝衰竭诊疗指南.中华肝脏病杂志, 2006, l4, 643-646.

[3]   Bajaj MS, Birktoft JJ, Steer SA, et al. Structure and biology of tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost, 2001, 86: 959-972.

[4]   Dusse LM, Carvalho MG, Cooper AJ, et al. Tissue factor and tissue factor pathway inhibitor: a potential role in pregnancy and obstetric vascular complications? Clin Chim Acta, 2006, 372: 43-46. 

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