脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，尤其是恶性程度最高的胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme，GBM)，复发率和病死率极高，其中位生存期约14个月，是青壮年首位肿瘤死因，被称为“新癌王”。绝大部分脑胶质瘤早期不易发现，往往在出现症状之后才能确诊。传统的诊断技术包括颅脑影像学检查和病变组织活检，但两者均有一定的局限性。

液体活检(liquidbiopsy)方便、快捷、非侵入性、可多次取样，更符合当下肿瘤精准诊疗的趋势。因此，研究适合脑胶质瘤的早期液体活检策略，筛选脑胶质瘤特异性液体活检肿瘤标志物，尤其是早期诊断和复发监测的标志物，是实现其精准诊疗的重要手段。

1.脑胶质瘤传统检查方法的局限性

颅脑影像学检查主要包括磁共振技术(MRI)、磁共振波谱分析(MRS)、SPET-CT、PET-CT等，在脑胶质瘤诊断和复发监测中发挥了重要作用，但对于影像学表现不典型或早期的脑胶质瘤病人诊断特异性较差。有研究表明，肿瘤细胞大小一般在10μm数量级上，而MRI空间分辨率只能达到2～3mm，因此，当MRI检测到肿瘤时，肿瘤细胞已经经历了二十多轮指数增长，这使得一些微小的肿瘤原发灶和复发灶难以被及时发现，最终错过最佳治疗时机。

此外，脑胶质瘤在治疗过程中，放、化疗会破坏血脑屏障，导致MRI扫描的对比度增加，被称为假性进展;相反，一些抗血管生成药物的使用会导致MRI扫描的对比度降低，被称为假性消退，这两者仅仅通过影像学检查都难以鉴别区分，可影响诊断的准确性，从而导致病人进行不必要的重复手术。

病变组织活检是目前脑胶质瘤诊断的“金标准”。病变活检是一种侵入性检查手段，有穿刺后出血、癫痫发作、肿瘤转移等风险，不适合反复多次检查;此外，由于脑胶质瘤存在异质性，不同部位的肿瘤性质往往有一定区别，导致取出的少量组织不能完全反映肿瘤整体情况，诊断有一定偏差。

另外，对于脑干、丘脑等重要部位的肿瘤，组织获取风险高，操作难度大，也不利于检查的进行。液体活检作为一种新兴的检查手段，具有方便、非侵入性、可反复取样、动态监测等特点，可以有效弥补这些传统检查手段的短板，虽然目前研究还不够成熟和深入，但值得进一步探索。

2.液体活检在脑胶质瘤中的应用

液体活检是对影像学难以判断的脑胶质瘤的一种辅助诊断方法，可以避免穿刺活检的风险并提高病变的早期确诊率。脑胶质瘤可以释放各种分子来调控细胞间的信号传导及代谢催化途径，这些分子可以通过循环到达体液，可以作为液体活检的标志物被分离和检测出来，用于脑胶质瘤的早期诊断和预后评估。

循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell，CTC)、循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ct-DNA)和蛋白质被认为是脑胶质瘤早期诊断和实时监测的标志物，CTC是指从实体肿瘤脱落进入外周循环系统的肿瘤细胞，它保留了来自原发肿瘤的特定分子特征，可以用于对原发肿瘤进行临床诊断，但目前针对脑胶质瘤CTC研究不多，样本量也少，并且每个研究分离CTC的方法不同，使得研究结果不具有可比性。

此外，CTC在脑胶质瘤病人体液中的含量远远低于正常细胞，10ml血液中只能发现一个或几个肿瘤细胞，而且纯度较低，难以反映整个脑胶质瘤的真实情况。因此，只有开发具有更高灵敏度的CTC检测手段才有可能应用于临床。ct-DNA是一种存在于血浆、脑脊液等体液中的细胞外DNA，主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞及循环肿瘤细胞。

血浆ct-DNA的液体活检已在许多实体肿瘤中进行了广泛研究，可以用于肿瘤负荷和突变的跟踪检测;由于血脑屏障的存在，脑胶质瘤ct-DNA在血液中含量极低，只在少数病人中可检测到。因此，脑脊液成为脑胶质瘤ct-DNA分离提取的最佳来源，但目前针对脑脊液ct-DNA的检测仍存在许多问题。

有研究表明，低级别脑胶质瘤(lowergradeglioma，LGG)生长速度缓慢，只有少数LGG释放到脑脊液中的ct-DNA可以被检测到;位于脑实质中的胶质瘤不与脑脊液相邻，它们的ct-DNA检测率也很低。此外，ct-DNA在分析前和分析阶段对环境的要求也非常苛刻，使得检测的稳定性难以保证，导致临床应用遇到诸多困难。

近年来，外泌体引起了越来越多的关注，已成为肿瘤液体活检的重要选择。外泌体是直径为30～150nm的细胞外囊泡，包含核酸(DNA，RNA，microRNA等)、蛋白质(膜受体、配体、细胞因子等)、脂质和一些代谢产物，参与肿瘤细胞间的信息传递及免疫微环境的形成。

研究证实，脑胶质瘤细胞分泌的外泌体可以调节其他肿瘤细胞和正常组织细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞、T细胞等)，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移，诱导血管生成，调节代谢活动，引起免疫抑制，影响药物耐受。

由于外泌体来自整个肿瘤组织细胞，所以可以包含更加丰富的信息，反映肿瘤整体状况，更加准确地对脑胶质瘤进行诊断及预后评估。与游离的核酸及蛋白质相比，外泌体包裹的生物大分子可以避免体液中循环的核酸酶及蛋白酶的降解，因此，针对外泌体进行检测，稳定性和敏感度要优于CTCs和ct-DNA等。基于以上特点，外泌体有可能成为脑胶质瘤液体活检的首要选择，针对脑胶质瘤异质性和突变性强的特点为病人提供个体化的诊疗方案。

3.脑脊液中胶质瘤相关外泌体在液体活检中的应用

血液和脑脊液是提取胶质瘤外泌体的两个最主要来源，脑胶质瘤外泌体具有穿透血脑屏障的能力，可以在外周血中被检测到。几乎所有器官的外泌体都可以进入血液，致使血液中的外泌体成分极为复杂，使得血液中胶质瘤外泌体的分离和纯化难度很大，导致提取的外泌体成分不纯，诊断的准确性大大降低。

脑脊液是一个相对封闭的环境，可以通过血脑屏障阻挡其它来源的外泌体，减少中枢神经系统之外的干扰，大大提高了胶质瘤外泌体的纯度，增加了诊断的准确性。在临床中，主要是通过腰椎穿刺术获取脑脊液，这虽是一种有创性的检查方式，即将穿刺针插入椎管的蛛网膜下腔来获取样本，这会给病人造成疼痛并伴有感染风险，但仍被认为是一种相对安全的操作。脑脊液目前被认为是脑胶质瘤液体活检的首要选择。

胶质瘤脑脊液外泌体液体活检在临床上主要用于检测一些特定分子的变化，包括EGFRvⅢ、IDH1突变蛋白或miRNA。有研究表明，在对71例GBM病人的多中心研究中，检测脑脊液外泌体中EGFRvⅢ的特异性高达98%，但敏感性较低，小于61%。IDH1的突变转录本也可以在胶质瘤病人的脑脊液外泌体中被检测到，敏感度为62.5%，特异度高达100%，但在血清外泌体中未检测到。

miRNA是一类小非编码RNA，可以在转录后水平调节基因的表达，与脑胶质瘤的发生发展密切相关。越来越多的研究证明，胶质瘤病人的脑脊液外泌体中存在上调或下调的miRNA，这些miRNA可以作为生物标志物用于诊断。miR-21已经被证明可以作为GBM的候选诊断标志物，GBM病人脑脊液分离的外泌体中miR-21的水平是正常对照组的10倍，且术后脑脊液外泌体中miR-21的含量明显下降。

多个miRNA的临床预测模型可提高诊断的敏感性和特异性。外泌体miR-21可以区分脑胶质瘤病人和健康对照，但是不能区分高级别胶质瘤和脑转移瘤，当结合miR-21、miR-222和miR-124-3p进行检测时，可以进行两者的区别诊断。

我们团队通过对59例脑胶质瘤病人肿瘤组织样本及其脑脊液外泌体进行全转录组测序，分析了液体活检中所有的RNA分子，包括miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA，证实只有miRNA可以作为液体活检的检测标志物。已有关于脑胶质瘤调控外泌体miRNA外排机制的相关报道。

研究认为，外泌体可作为肿瘤促进分子的载体将促癌的miRNA传递给其他的肿瘤细胞和免疫微环境中的免疫细胞，从而促进肿瘤细胞的恶性进展。近期，我们课题组研究发现，脑胶质瘤可以通过将抑癌miRNA分选到外泌体内，排出肿瘤细胞起到促癌的作用;并可通过将这些抑癌miRNA利用外泌体靶向运载至肿瘤微环境中的抑制性髓系免疫细胞(肿瘤相关巨噬细胞TAMs或髓系抑制细胞MDSCs)，发挥促进肿瘤免疫微环境恶化的作用，起到双重促肿瘤作用，我们团队在国内外首次提出这一理论，相关研究成果已在国际权威杂志上进行发表。

基于此测序结果我们建成了首个多中心脑胶质瘤全组学液体活检大数据队列(临床注册研究ChiCTR2000032547)及液体活检在线数据库BrainLiquid和脑胶质瘤脑脊液外泌体数据库CEGA(ChinaExo-gliomaGenomicsAtlas)，并配套完成了类器官标本库的构建工作，数据库做到了“全病程、全标本、全组学”覆盖。

在前期的小规模队列研究中，我们发现基于脑脊液外泌体miRNA的GBM复发监测策略，不仅能够显著提高早期复发病灶的检出率，还能将传统影像学诊断复发的时间窗提前约6个月。为了进一步提高脑脊液外泌体miRNA检测的便捷性，我们又联合交叉学科团队研发了基因床旁快速诊断设备，通过微流控芯片实现外泌体肿瘤分子标志物检测，开展并完善基于脑脊液外泌体miRNA的脑胶质瘤液体活检床旁技术。

4.问题与展望

液体活检是早期筛查和诊断脑胶质瘤的有效手段，在病人个体化诊疗、疗效评估及复发检测等方面具有指导意义。外泌体作为一种可靠的标志物可以在脑脊液和血液中被检测到，其包裹的各种分子可以更加全面地反映胶质瘤的整体情况，提高了脑胶质瘤诊断的准确性;虽然胶质瘤外泌体作为液体活检的重要标志物具有很大的潜力，但目前仍面临诸多的挑战与困难。

由脑脊液提取外泌体可以避免其他来源外泌体的干扰，但腰椎穿刺术仍是一种有创性检查手段，不利于反复多次进行;从血液中纯化外泌体对病人伤害小，风险低，操作简便，是理想的液体活检采样途径。因此，研发更加优化的外泌体分离提取及检测技术，通过血液中的外泌体来诊断胶质瘤，是未来需要解决的重要课题。目前，虽然对胶质瘤外泌体研究很多，但仍缺少可以明确用于胶质瘤诊断的分子。

总之，在当今肿瘤精准医疗的时代背景之下，以脑胶质瘤外泌体为靶标的液体活检可以有效弥补传统检查手段的缺点，使得操作更加简便、结果更加准确、成本更加低廉，有助于对病人进行个体化精准诊疗。

来源：亓彦华,薛皓,李刚.脑胶质瘤液体活检技术研发和临床应用[J].临床外科杂志,2022,30(10):914-916.