靶向治疗和免疫检查点抑制剂治疗目前已显著改善了肿瘤患者的生存率，而新型疗法的有效运用往往需要依赖于对基因变异的准确检测。当前的研究表明，诸如NTRK(神经营养因子受体酪氨酸激酶)等罕见的融合变异事件能有效地驱动肿瘤发生，并成为多种肿瘤中靶向治疗的靶标。基于DNA检测的大Panel可以覆盖几百个癌基因，是大规模探测突变的强有力工具，但在融合/重排检测方面仍具有一定挑战。靶向二代测序是一种能够综合鉴定癌症生物标志的方法，根据不同的变化情况，起始的检测材料可为DNA或 RNA，但分别进行两次检测会增加工作负担且常常不可实现，进而延误或完全没有检测到关键变异事件，特别是那些有效的可靶向治疗的融合事件。故单次检测中通过精简的程序即可同时分析两种模板(DNA和RNA)是实际工作中的迫切需求。

近日，由浙江省肿瘤医院牵头，恒特基因等国内多家单位共同合作完成的一项研究发表在医学实验技术领域核心期刊Clinical Chemistry上，题目为“Simultaneous Detection of Gene Fusions and Base Mutations in Cancer Tissue Biopsies by Sequencing Dual Nucleic Acid Templates in Unified Reaction”。作者们报道了一种整合的NGS检测方法，能够检测报告出从组织样本中提取的总核酸(TNA)中的多种变异类型，并极大地简化了变异检测流程。

研究者们开发了称为平行扩增数字优化测序(PANO-Seq)的检测方法，能够将组织样本中提取的总核酸(TNA)直接转化为一个NGS文库，而无需在实验操作过程中将基因组DNA(gDNA)和RNA分别建库。利用PANO-Seq，他们从66例新鲜的肺癌组织切片样本的预队列中检测到的突变有：EGFR(27例)，KRAS(4例)，PIK3CA(4例)，BRAF和细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2A)(各1例)。此外，还鉴定到3例融合变异，包括2例EML4-ALK融合和1例驱动蛋白家族成员5B-转染期间重排激酶(KIF5B-RET)融合，证明了一次同时检测多种变异类型和双模板检测的目标是切实可行的。

图1. 在单个反应管中用一个统一的方法同时对 DNA和RNA进行测序

后续大样本量研究中，研究人员收集了1095例患者的FFPE样本，这些样本的年限从小于1年到大于5年不等。本队列涵盖肺癌已知的各种亚型，包括815例腺癌(74.4%)，183例鳞状细胞癌(16.7%)和97例其他类型或未分类的病例(8.9%)。用于检测的靶向重测Panel含有179个扩增子，覆盖了10个基因的32个外显子和启动子(基于DNA检测点突变和插入缺失)，基于RNA检测14个基因的融合变异，同时覆盖了3个基因的12个内含子，使得RNA质量差的样本可通过DNA模板来检测融合。

结果显示，成功测序及分析的文库，上靶率为60.1%，除重后平均测序深度12622，70%以上目标区域测序深度达到0.2倍平均测序深度以上。小于50bp的扩增子(模板完整性的指标)占比为48.9%。对培养的细胞系样本与FFPE样本的分析结果进行对比，发现细胞系样本模板完整性显著高于FFPE样本，表明这些实际样本表现很大程度上受临床样本质量影响。值得注意的是，可通过调节引物池中相关引物的浓度方便地优化检测的均一性，表明这一检测平台是十分灵活的。

相较于DNA，RNA不稳定易降解，因此在NGS测序之前对样本的质量进行系统评估是非常重要的。然而，传统的核酸定量检测方法，可能无法准确测定核酸模板的质量或区分RNA和DNA。研究人员开发了pre-NGS qRT-PCR 的质控方法，用来评估双RNA/DNA模板的质量，并分析所有可获得的组织样本，证明其是一种在NGS工作流程中比传统方法更高效的检测方法。

图2. RNA质量分析和二代测序上机前的评估检测

以高于FFPE样本基线的5%MAF作为截断值，研究人员发现，所有患者中有834例携带有至少一个突变。总体上，DNA测序数据达到可接受的质控要求的患者中，有79%(739/935)携带一个相关突变事件，且45%(421/935)位于热点区域。进一步，研究者们将检测到的每一种突变类型，至少取1例样本使用Sanger测序法单独检测，用于确证本检测的结果的正确性。对32例作为最常见的突变类型代表的EGFR_L858R病例和20例阴性的样本进一步进行验证，结果证实了所有结果均完全一致。

所有患者中，有69例为融合阳性;在RNA测序数据达到可接受的质控要求的亚组中融合阳性率为7.7%(58/754)。其中ALK、ROS1、RET这三个基因的融合占了绝大多数的融合事件。另外还检测到6例MET 14号外显子跳读，1例HLA II类分子的组织相容性抗原DRB1的β链与MET发生的融合(HLA-DRB1-MET，这一融合之前仅被报道过一次)，以及BRAF(BBS9-BRAF和AGK-BRAF) 和神经调节蛋白1 (NRG1) (CD74-NRG1和MKL2-NRG1)四例融合事件。在这一队列中另检出了多个NTRK1融合病例将另案报道。

图3. 融合及热点突变信息汇总

此外，34例融合阳性的病例中，每种融合类型至少有1例代表性病例以及最常见的基因间ALK融合和MET 14号外显子跳读的所有病例，得到了Sanger测序的确证。29例阴性的样本也进行了ALK的检查，结果均为ALK阴性。因此，本检测方法能够准确且有效的检测出已知及新颖的融合变异事件，同时还能够并行检测其他部分的遗传变异。

该研究代表了一种努力方向，即开发一种具有广泛包容性的检测方法，可同时测定核心的可治疗靶点及罕见但有效的融合变异事件，并能够对很大一部分肺癌(及其他)患者的治疗产生潜在影响。这一方法不仅有益于大部分的携带核心可治疗靶标的患者，也给那些携带有罕见变异的患者带来获益。未来，研究人员将进一步扩展这一分析方法，使其能够检测靶基因的RNA表达和DNA拷贝数特征如PD-L1，为免疫检查点抑制剂的治疗提供额外的生物标志物信息。

原始出处：

Zhengbo Song, Chunwei Xu, Yunwei He, et.al.Simultaneous Detection of Gene Fusions and Base Mutations in Cancer Tissue Biopsies by Sequencing Dual Nucleic Acid Templates in Unified Reaction Simultaneous Detection of Gene Fusions and Base Mutations in Cancer Tissue Biopsies by Sequencing Dual Nucleic Acid Templates in Unified Reaction.Clinical ChemistryDecember 2019