之前的研究依赖于使用基因组整合的LacO/TetO阵列，这既枯燥又有挑战性。与荧光蛋白融合在一起的没有核酸酶活性的dCas9，或者招募单向导RNA(sgRNA)的与荧光蛋白融合在一起的RNA结合蛋白能够对基因组位点进行CRISPR介导的实时成像。但是，对编码CRISPR组件的DNA的需要限制了它的使用。传统的荧光原位杂交(FISH)需要DNA变性，同时在体外与sgRNA组装在一起的荧光标记dCas9(CASFISH)仅检测固定样本中的基因组位点，这就限制了实时追踪。

在一项新的研究中，来自美国斯坦福大学、卡斯迪加学校和中国浙江大学的研究人员报道了一种称为CRISPR活细胞荧光原位杂交(CRISPR live-cell fluorescent in situ hybridization, CRISPR LiveFISH)的实时成像方法，从而允许研究活细胞中的各种染色体功能。相关研究结果发表在2019年9月20日的Science期刊上，论文标题为“CRISPR-mediated live imaging of genome editing and transcription”。

这些研究人员首次将等摩尔含量的蛋白dCas9-EGFP(即与增强型绿色荧光蛋白融合在一起的dCas9)和经过Cy3标记的向导RNA(gRNA)组装成荧光核糖核蛋白(fRNP)，所组装而成的fRNP靶向3号染色体(Chr3)中的一个重复序列区域(Chr3q29，大约500次重复)。他们通过电穿孔将fRNP递送到人骨肉瘤U2OS细胞中。流式细胞仪分析表明95%以上的gRNA信号在转染之后的4小时内受到降解，这与之前报道的gRNA在细胞环境中高度不稳定相一致。然而，他们观察到Cy3-gRNA对这个Chr3位点(即Chr3q29)的快速且持久的标记，这表明稳定的与靶标结合在一起的dCas9-gRNA复合物形成了。Cy3-gRNA的信噪比(signal-to-background ratio, S/B)比dCas9-EGFP的S/B高4倍以上。与经常在核仁中聚集的dCas9-EGFP不同的是，Cy3-gRNA并不在核仁中聚集。通过进行体外测定，他们发现过量的靶DNA而不是非靶DNA，保护Cas9:gRNA:DNA三元复合物中的Cy3-gRNA免受核糖核酸酶A降解。此外，相比于存在不小于6个碱基对(bp)错配的靶DNA，结合着dCas9的Cy3-gRNA更好地受到完全匹配的靶DNA或者在PAM(protospacer adjacent motif, 前间隔序列邻近基序)远端存在不大于4bp错配的靶DNA的保护。

基于这种靶DNA依赖性的gRNA保护，这些研究人员开发出CRISPR LiveFISH，即一种部署与dCas9组装在一起的荧光gRNA探针来靶向和标记活细胞中基因组序列的方法。他们在来自巴陶综合征(Patau Syndrome)患者的细胞中测试了这种方法，其中巴陶综合征是一种13号染色体(Chr13)三体遗传病，它导致器官缺陷、智能障碍和身体缺陷，并且最终是致命性的。他们将含有dCas9和Atto565标记的gRNA(Atto565-gRNA)且靶向Chr13上的一个重复序列区域(Chr13q34，大约350次重复)的fRNP转染到正常的或者源自患者的产前羊水细胞中，并检测到Atto565-gRNA快速且稳健地标记Chr13，这优于dCas9-EGFP RNP标记或基于质粒的成像。CRISPR LiveFISH的高效率可通过核型分析进行定量，它的准确性可通过核型分析进行证实。简单地共递送经过不同的荧光团标记的fRNP能够同时地可视化观察U2OS细胞和人原代T细胞中的Chr3重复序列区域和Chr13重复序列区域。之前利用正交dCas9或将sgRNA与RNA适配体(RNA aptamer)和RNA结合蛋白偶联在一起的方法需要多个构造体。

这些研究人员随后利用CRISPR LiveFISH来研究CRISPR-Cas9在活细胞中诱导的DNA双链断裂(DSB)的实时动态变化。他们构建出稳定地表达与荧光Apple蛋白融合在一起的截断53BP1蛋白(aa1220-1711)的U2OS细胞系(以下称为U2OS-53BP1-Apple细胞)，其中53BP1蛋白是一种得到很好描述的DNA DSB传感蛋白。人类基因组含有通常与大多数蛋白编码基因(>60%)相邻的重复序列(<100kb)。他们通过核转染方法将切割Chr3中PPP1R2基因的基因编辑RNP(Cas9/gPPP1R2)和对Chr3q29重复序列区域进行标记的CRISPR LiveFISH fRNP(Cas9/A488-gChr3)共递送到U2OS-53BP1-Apple细胞中，其中Chr3q29重复序列区域与PPP1R2切割位点相距36kb。为了避免fRNP介导的DNA切割，他们针对成像gRNA使用了一个短的间隔序列，这不足以进行DNA切割。在转染后不久，他们很快就观察到在含有基因编辑gRNA的细胞中，较高比例的Chr3q29位点与53BP1位点共定位在一起，这表明在PPP1R2位点上快速形成了Cas9诱导的DSB。按序递送成像fRNP和基因编辑RNP能够让他们随着时间的推移追踪单个位点上的DSA形成和53BP1招募过程。在递送基因编辑RNP之后，他们连续数小时地捕捉到53BP1位点快速地和正在招募到53BP1位点。

这些研究人员能够追踪基因编辑事件的动态变化。比如，他们观察到53BP1位点招募Chr3q29位点，随后与Chr3q29位点脱离开来，这可能表明成功修复了DNA DSB。他们还在很多细胞的单个DNA位点上观察到53BP1位点的重复招募和脱离，这表明对靶DNA重复进行切割和修复。最终，在将基因编辑RNP递送到一些细胞之后，多个Chr3q29位点簇集在相同的53BP1位点内，这表明正如之前报道的那样，在DNA DSB位点之间发生同源配对。最初在单独的Chr3q29位点上形成的两个53BP1小体快速地融合在一起，相应地这些同源的Chr3q29位点在融合的53BP1小体内相互作用，这表明53BP1小体融合可能促进同源DSB位点配对。

利用CRISPR对多个基因进行编辑对基因疗法比较重要，但是这能够引入有害的非同源染色体重排。为了可视化观察染色体易位，这些研究人员共递送靶向Chr3中PPP1R2和Chr13中SPACA7的基因编辑RNP和CRISPR LiveFISH fRNP来追踪Chr3q29和Chr13q34(与SPACA7切割位点相距82kb)。在通常是非整倍体的U2OS细胞中，53BP1免疫染色证实了DSB在靶位点上形成。他们能够观察到Chr3q29位点和Chr13q34位点之间的配对。这两个位点显示了几乎相同的运动轨迹，而且它们之间的距离几乎保持恒定，这表明这两个位点之间可能物理连接。他们追踪了这些染色体易位的动态变化。Chr3q29和Chr13q34最初是分开的，随后彼此靠近，并且在很长一段时间内保持在一起，这可能代表着内源性非同源染色体易位。他们还捕捉瞬时事件，在这些瞬时事件中，Chr3q29位点和Chr13q34位点短暂地一起移动并分离开来。为了独立地证实染色体易位，他们进行发生易位的染色体片段进行克隆、测序和验证。

这些研究人员进一步扩展了CRISPR LiveFISH，以便实时地对DNA和RNA进行成像观察。他们利用催化失活的Cas13d(CasRx)--- dCas13d---和人工合成的荧光标记gRNA进行靶RNA成像观察。U2OS 2-6-3细胞系携带一个位于强力霉素(Dox)诱导性基因盒上游的LacO重复序列阵列，其中这种基因盒含有MS2重复序列阵列。为了同时可视化观察DNA和RNA，他们设计了Atto488标记的靶向LacO DNA的Cas9 gRNA(下称gLacO)，设计了Atto647标记的靶向MS2 RNA的Cas13d gRNA(下称gMS2)。通过共递送gMS2和dCas9/gLacO到表达dCas13d的U2OS 2-6-3细胞中，他们成功地在Dox的存在下对DNA位点和RNA转录本进行标记。CRISPR LiveFISH也能够让他们追踪活细胞中RNA转录的实时动态变化。在利用高浓度Dox诱导转录后，他们在一段时间内观察到MS2转录本在LacO位点附近主逐渐地聚集。

终上所述，这些研究人员报道了用于活细胞DNA和RNA成像的CRISPR LiveFISH技术。化学合成的荧光gRNA与dCas蛋白形成的复合物能够促进快速稳健地、可扩展地对细胞(包括原代细胞)中的基因组DNA进行追踪和对细胞中的RNA进行成像。在富含核糖核酸酶的环境中，对Cas9:gRNA:DNA三元复合物中gRNA的靶DNA依赖性保护会富集靶信号，同时让背景噪音最小化。CRISPR LiveFISH也允许对活细胞中内源性基因组位点上发生的CRISPR诱导的基因编辑和易位事件进行动态追踪。使用dCas9和dCas13系统的双DNA/RNA CRISPR LiveFISH能够对相同细胞中的基因组DNA和RNA转录本进行实时成像。人们有可能将CRISPR LiveFISH与其他的基因操纵技术(比如，CRISPRi/a、表观遗传修饰和CRISPR-GO)结合使用来加深对基因组组装和细胞核事件的时空动态变化的理解。