2018年11月26日，中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改，使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵，引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究，但是更多的是质疑，甚至是谴责。

        即将过去的2月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢?小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。

        1.重大进展!两篇Nature Medicine揭示一种新型CRISPR/Cas9疗法有望治疗早衰症

        doi:10.1038/s41591-019-0343-4; doi:10.1038/s41591-018-0338-6

        衰老是导致包括心脏病、癌症和阿尔茨海默病在内的许多衰竭性疾病的主要风险因素。这使得对抗衰老疗法的需求变得更加迫切。如今，在一项新的研究中，来自美国沙克生物研究所的研究人员开发出一种新的基因疗法来帮助减缓这种衰老过程。相关研究结果于2019年2月18日在线发表在Nature Medicine期刊上，论文标题为“Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome”。

        这些研究结果重点介绍了一种新的CRISPR/Cas9基因组编辑疗法。它能够抑制哈钦森-吉尔福德早衰症综合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome)小鼠模型中观察到的加速衰老。作为一种罕见的遗传疾病，哈钦森-吉尔福德早衰症综合征也折磨着人类。这种疗法对参与加速衰老的分子通路以及如何通过基因疗法减少有毒蛋白积累提供了重要见解。

        由于早期发作和快速进展，早衰症是由LMNA基因突变引起的一组退行性疾病中的最严重形式之一。患有早衰症的小鼠和人类都表现出许多衰老的迹象，包括DNA损伤、心脏功能障碍和寿命显著缩短。LMNA基因通常在细胞内产生两种相似的蛋白：核纤层蛋白A(lamin A)和核纤层蛋白C(lamin C)。早衰症将核纤层蛋白A的产生切换到早衰蛋白(progerin)的产生。早衰蛋白是核纤层蛋白A的一种缩短的有毒形式，它随着年龄的增长而累积，并且在早衰症患者中加剧产生。

        这些研究人员利用CRISPR/Cas9系统将基因疗法递送到表达Cas9的早衰症小鼠模型的细胞中。为此，他们采用了含有两种合成向导RNA(gRNA)和一种报告基因的腺相关病毒(AAV)。gRNA引导Cas9蛋白到达DNA上的特定位点，在那里，它能够进行切割，使得核纤层蛋白A和早衰蛋白失去功能，同时不会破坏核纤层蛋白C。这种报告基因有助于他们追踪受到AAV感染的组织。

        在递送这种基因疗法两个月后，这些小鼠变得更强壮和更活跃，而且它们的心血管健康得到改善。它们表现出下降的主要动脉血管退化和延迟的心跳过缓(bradycardia)发作---在早衰症和老年时常见的两个问题。总体而言，这些接受治疗的早衰症小鼠具有与正常小鼠相似的活动水平，而且它们的寿命增加了大约25%。

        与此同时，在另一项新的研究中，西班牙奥维耶多大学的José M. P. Freije、Carlos López-Otín及其团队开也发出一种基于CRISPR/Cas9的疗法来治疗哈钦森-吉尔福德早衰症综合征。对这种疗法的测试结果表明，它通过在LMNA基因中引入移码突变(frameshift mutation)逆转了在哈钦森-吉尔福德早衰症综合征小鼠模型和来自患上这种疾病的患者的细胞中发生的一些有害变化。相关研究结果于同日在线发表在Nature Medicine期刊上，论文标题为“Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome”。

        2.CRISPR J：将Cas9与染色质调节肽进行融合，可提高CRISPR-Cas9编辑效率

        doi:10.1089/CRISPR.2018.0036

        通过Cas9核酸酶靶向感兴趣位点的CRISPR基因组编辑工具在效率上差异很大。在一项新的研究中，来自MilliporeSigma公司的研究人员报道一种新的称为CRISPR-chrom的染色质调节肽(chromatin-modulating peptide, CMP)融合策略可将CRISPR-Cas9的基因组编辑活性提高数倍。CRISPR-chrom是通过将Cas9与CMP融合在一起形成的。相关研究结果于2019年2月21日在线发表在The CRISPR Journal期刊上，论文标题为“Improving CRISPR-Cas9 Genome Editing Efficiency by Fusion with Chromatin-Modulating Peptides”。

        在这项新的研究中，MilliporeSigma公司的Fuqiang Chen及其团队开发出他们利用已知与染色质天然地相互作用的肽对Cas9进行修饰的方法。他们证实通过采用CRISPR-chrom 策略，CRISPR-Cas9的编辑活性显著增加，特别是在之前很难靶向的位点上。他们还报道了脱靶效应没有显著增加。此外，他们还使用了与流行的SpyCas9存在垂直同源关系的Cas9蛋白进行概念验证，从而进一步扩展了CRISPR工具包并为进行多重编辑提供了新的机会。

        3.Nucleic Acids Res：新方法实现CRISPR/Cas9瞬时表达和高效编辑

        doi:10.1093/nar/gkz093

        在一项新的研究中，来自美国维克森林大学再生医学研究所(WFIRM)的研究人员找到了一种更好的递送DNA编辑工具CRISPR/Cas9的方法来缩短它们在细胞中的存在时间，他们称之为“打了就跑(hit and run)”方法。相关研究结果于2019年2月13日在线发表在Nucleic Acids Research期刊上，论文标题为“Delivering SaCas9 mRNA by lentivirus-like bionanoparticles for transient expression and efficient genome editing”。

        论文共同通讯作者、维克森林大学再生医学研究所再生医学助理教授Baisong Lu博士说道，“CRISPR/Cas9 mRNA技术面临的主要挑战之一是可能发生导致肿瘤或突变的脱靶切割。”虽然其他类型的慢病毒样生物纳米颗粒(lentivirus-like bionanoparticle, LVLP)已用于递送蛋白或mRNA，但Lu说，“我们开发的LVLP具有独特的功能，这将使它成为一种扩展基因组编辑工具箱的有用工具。”

        为了解决这一不准确问题，这些研究人员提出了一个问题：是否有办法高效地递送Cas9基因同时让这种基因组编辑蛋白瞬时表达?他们测试了各种策略，然后利用两种广泛使用的递送载体---慢病毒载体和纳米颗粒---的最佳特性，并将它们组合在一起，构建出一种高效地将Cas9 mRNA包装到LVLP中的系统，从而实现Cas9的瞬时表达和高效编辑。

        4.加州大学伯克利分校将在美国获得第三件CRISPR专利

        新闻来源：UC Berkeley Team to Be Awarded CRISPR Patent

        美国加州大学伯克利分校及其开发CRISPR基因编辑的合作伙伴(下称伯克利团队)将获得一件CRISPR专利，它是伯克利团队与美国布罗德研究所及其CRISPR合作者(下称布罗德团队)之间知识产权纠纷的核心。在2019年2月8日(星期五)，美国专利商标局(USPTO)发布了针对这件专利申请(专利申请号为13/842859)的“准许通知(notice of allowance)”，这表明它将在未来几周内被授予专利权。

        这件专利申请再加上之前已被授予给加州大学伯克利分校的两件专利(专利申请号分别为10/000772和10/113167)涵盖了在任何环境下(包括在体外、在活的植物、动物以及人体细胞中)用作基因编辑剪刀的CRISPR-Cas9的方法和组合物。

        加州大学CRISPR事务首席专利战略家Eldora Ellison(也是法律公司Sterne, Kessler, Goldstein & Fox的一名董事)在这份声明中表示，“我们很高兴这件专利申请如今将被授予专利权，而且它将涵盖在任何细胞或非细胞环境中使用CRISPR-Cas9技术。我们期待在未来几个月内观察到加州大学的CRISPR专利组合将保持继续扩大的势头。”

        5.Nat Biotech：CRISPR给ips披上隐身衣!破解移植排斥难题!

        doi:10.1038/s41587-019-0016-3

        自体的诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells，ipsCs)是病人特异性的基于细胞的器官修复策略的一个无限的细胞来源。但是它们的产生以及接下来分化成为特殊的细胞或者组织需要细胞系特异性的操作成为了一个挑战，这个过程缓慢，使得这种方法无法用于急性疾病的治疗。

        近日来自加州大学旧金山分校的科学家们首次使用CRISPR-Cas9基因编辑系统去创造出了第一个免疫系统“看不见的”多功能干细胞，这是一个生物工程壮举，这个方法在实验室的动物模型中成功地防止了干细胞移植的免疫排斥作用。由于这种通用的干细胞比病人个体化定制的干细胞更容易生产，因此这个方法让我们距离实现再生医学的终极目标更近了一步。

        为了让免疫系统无法识别这些干细胞，研究人员使用CRISPR-Cas9系统敲除了干细胞的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)1和2对应的基因并使之高表达CD47，发现无论是小鼠还是人体来源的iPSCs都失去了免疫原性。这种无免疫原性的ipsCs可以维持它们的多功能干细胞的潜能以及分化的能力。

        由无免疫原性的小鼠或者人ipsCs分化而来的内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞都成功地避开了MHC完全不匹配的异体受体的免疫排斥作用，同时在不使用免疫抑制剂的情况下可以长期存活。这些发现表明这种无免疫原性的细胞移植物可以进一步开发用于通用的移植产品。

        6.Nat Med：CRISPR技术有助于治疗杜氏肌营养不良

        doi:10.1038/s41591-019-0344-3

        通过对小鼠进行长达一年的研究，杜克大学的研究人员已经证明，使用CRISPR基因组编辑技术进行治疗可以安全，稳定地纠正一种名为杜氏肌营养不良症(DMD)遗传性疾病。该研究于2月18日在线发表在《Nature Medicine》杂志上。

        领导这项工作的Gersbach实验室的博士后研究员克里斯托弗·尼尔森(Christopher Nelson)对携带缺陷型肌营养不良蛋白基因的成年和新生小鼠静脉内施用单剂量的CRISPR疗法。在接下来的一年中，研究人员测量了成功编辑了多少肌肉细胞以及进行了哪些类型的遗传改变，以及针对细菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫应答的发生。

        为了全面地绘制肌营养不良蛋白基因中发生的所有编辑，作者进行了DNA测序。令人惊讶的是，除了目标外显子的预期去除之外，还发生了许多类型的编辑，包括从编码CRISPR / Cas9系统的病毒载体中高度插入DNA序列。

        根据组织的类型和CRISPR的使用剂量，多达一半的目标编辑导致这些替代序列变化。尽管该结果令人惊讶，但是非预期的序列变化似乎不会影响该CRISPR / Cas9基因编辑方法对DMD的安全性或功效。

        “因为肌营养不良蛋白基因已经存在缺陷，在这种情况下，这些编辑情况不一定会引起关注。尽管如此，任何意想不到的结果都可能会剥夺你试图实现的基因编辑的效率，这支持了设计在未来研究中客观地识别和减轻替代编辑的方法的重要性。”

        7.Nat Biotechnol：开发出更加高效的CRISPR–Cas12a变体

        doi:10.1038/s41587-018-0011-0

        在一项新的研究中，来自美国麻省总医院、哈佛医学院和麻省理工学院的研究人员设计了能够靶向更广泛的前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)的Cas12a变体。相关研究结果于2019年2月11日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Engineered CRISPR–Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing”。在这篇论文中，他们描述了他们设计的这些Cas12a变体，以及与传统的Cas12a核酸酶进行比较时，它们如何作出表现。

        利用诸如Cas12a之类的基因剪接工具开展实验的科学家们想知道这些工具是否有朝一日能够用于编辑人类基因组，以便改善健康和幸福感---比如移除导致遗传性疾病的基因。尽管这样的研究具有很大的前景，但是现有的基因剪接工具当前被认为太不可靠而无法用于人体中。比如，它们有时会切割错误的基因组位点，或者在插入正确的片段时遇到问题。人们还担忧切割靶标---PAM---附近的部分DNA片段受到损伤。在这项新的研究中，这些研究人员设计了Cas12a核酸酶的变体，他们声称这些变体提供了扩大的靶向范围，包括一些以前难以接近的PAM。

        这些研究人员报道特别地，一种称为enAsCas12a的变体并不需要扩展的输血传播病毒(extended transfusion-transmissible virus, TTTV)PAM，当然，野生型AsCas12a需要这种TTTV PAM。与AsCas12a野生型相比，这种变体在典型的TTTV PAM存在时平均具有两倍高的基因组编辑活性。它的靶向范围扩大了：增加了七倍。他们进一步报道他们成功地将来自enAsCas12a的一部分突变片段移植到AsCas12a上来改善后者的活性。他们声称，开发出的enAsCas12a允许更高效地进行多重基因编辑，并提供内源性基因激活和C→T碱基编辑。为了降低利用enAsCas12a观察到的高于正常的脱靶效应，他们还设计了另一种称为enAsCas12a-HF1的变体。

        8.Genetics：嵌套CRISPR利用长片段进行高效的基因组编辑

        doi:10.1534/genetics.119.301965

        在一项新的研究中，西班牙Bellvitge生物医学研究所(IDIBELL)的Julián Cerón博士及其团队使用秀丽隐杆线虫来优化这种技术，从而开发出一种称为嵌套CRISPR(nested CRISPR)的方法。这种非克隆方法涉及分两步插入长DNA片段。在第一步中，将这个长片段DNA的一小部分(小于200个碱基)插入到基因组中。在第二步中，这一小部分DNA片段随后起着“巢穴”或“着陆垫(landing pad)”的作用，用于高效地插入较长的DNA片段(大约1000个碱基)。相关研究结果于2019年1月31日在线发表在Genetics期刊上，论文标题为“Efficient Generation of Endogenous Fluorescent Reporters by Nested CRISPR in Caenorhabditis elegans”。

        这项研究引起了前所未有的兴趣。具有短生命周期的模式生物(比如秀丽隐杆线虫)使得科学家们能够探究CRISPR的可能性和局限性。论文第一作者Jeremy Vicencio与博士后研究员Carmen Martínez和Xènia Serrat一起，在秀丽隐杆线虫生殖细胞中进行了数百次显微注射并开展了上千次基因分型，从而可靠地和令人信服地证实了嵌套CRISPR的效率。

        9.Nature：科学家发现新型的CRISPR基因编辑工具：CasX

        doi:10.1038/s41586-019-0908-x

        在短短7年时间里，Cas9已经成为了在人类、植物、动物和细菌中能够被使用的强大基因编辑工具，其能快速并准确地切割和拼接DNA，其也有望帮助开发治疗多种人类疾病的新型疗法。日前，一项刊登在国际杂志Nature上的研究报告中，来自加州大学伯克利分校的科学家们通过研究发现了一种新型的小型CRISPR基因编辑工具：CasX，其与蛋白Cas9较为相似，但比Cas9小很多。

        实际上，CasX是细菌和人类细胞中潜在的一种有效基因编辑工具，其似乎是在细菌中进化出的独立于其它Cas蛋白的一种特殊蛋白，CasX能够切割双链DNA，结合DNA并调节基因的表达，同时还能靶向作用特殊的DNA序列。由于CasX来自于细菌细胞中，因此相比Cas9而言，人类机体免疫系统或许能够更加容易地接纳CasX。

        研究者Benjamin Oakes说道，基因编辑工具的免疫原性、传递和特异性都非常重要，我们对CasX也抱有很大希望;这项研究中，研究者利用冷冻电子显微镜捕捉到了CasX蛋白在基因编辑过程中的快照图像，基于蛋白质的特殊分子组成和形状，研究者表示，CasX的进化独立于Cas9，其二者并无共同祖先。

        10.Cell子刊：在土壤和粪便中发现4种新型抗CRISPR蛋白

        doi:10.1016/j.chom.2019.01.003

        在一项新的研究中，来自丹麦诺和诺德基金会生物可持续性研究中心(DTU)的研究人员发现了四种新分布在不同环境中的抗CRISPR蛋白(anti-CRISPR protein)。他们指出一些抗CRISPR蛋白在自然界中要比之前预期的更为广泛地存在。这些抗CRISPR蛋白在未来能够潜在地用于调节CRISPR-Cas9系统的活性。相关研究结果于2019年2月5日在线发表在Cell Host & Microbe期刊上，论文标题为“Discovery and Characterization of Cas9 Inhibitors Disseminated across Seven Bacterial Phyla”。

        这些研究人员通过使用来自四个人类粪便样本、两个土壤样本、一个奶牛粪便样本和一个猪粪便样本的总DNA来鉴定抗CRISPR基因。将这种DNA切成小片段并让它们在细菌细胞内的质粒上随机表达。这种细菌细胞含有用于筛选抗CRISPR活性的基因回路。简而言之，这意味着如果细菌细胞含有的质粒携带着潜在的抗CRISPR基因，那么它们就会对某种抗生素产生抗性。反之，如果细菌细胞含有的质粒没有抗CRISPR活性，那么它们就会死亡。

        通过使用这种宏基因组文库方法，这些研究人员能够轻松地检测和筛选出具有抗CRISPR活性的DNA片段并追溯至其起源。最终，他们能够鉴定出能够抑制Cas9活性的11个DNA片段。随后，进一步的实验能够证实了四种新型抗CRISPR蛋白的活性。系统发育分析表明，这些在粪便样本中鉴定出的基因存在于多种环境中的细菌内，比如生活在昆虫肠道、海水和食物中的细菌。这表明这些新发现的基因在生命进化树的许多细菌分支中传播，并且在某些情况下有证据表明这些基因中的一些在进化过程中已发生多次水平转移。