短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统为细菌或古细菌中抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。CRISPR/Cas9系统有3种类型，美国学者杜德纳(JenniferDoudna)2012年研究发现了Ⅱ型系统并将其改造后，目前只须简易操作，即可进行可靠、高效、快速、精准的基因编辑。

继2012年、2013年连续被评为《自然》(Nature)年度科技突破后，2015年度的生命科学突破奖，再次花落CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统的创始者沙尔庞捷(EmmanuelleCharpentier)和Doudna，也在2015年美国《时代》周刊的全球百位最具影响力人物评选中榜上有名。

2015年3月、4月，《科学》(Science)和《细胞》(Cell)杂志相继推出特别合辑，回顾了CRISPR在不同领域突出成果。迄今为止，研究者已成功构建人肝癌、肺腺癌小鼠模型，发现了癌症逃脱机制、成功绘制癌症逃脱路线图;在小鼠模型试验中，研究者通过CRISPR/Cas9系统可清除潜伏感染的诸如乙型肝炎病毒等病毒基因组，可修复诸如囊性纤维化等遗传基因缺陷;这些突破，不仅让我们看到了CRISPR蕴藏着无限潜能，更让我们对克服长期危害人类健康的难治愈疾病更有信心。

然而，随着利用CRISPR/Cas9系统操控细胞和组织的研究不断增加，一些研究者尝试在人类生殖细胞或胚胎上使用这一技术，这引发了全球持续性争议。2015年4月，中国学者在《蛋白质与细胞》杂志上发表了全球首篇关于人类胚胎基因编辑的研究成果，引起舆论的轩然大波。在近日公布的美国情报界年度全球威胁评估报告中，更是将基因编辑技术列入“大规模杀伤性与扩散性武器”威胁清单中。

在本期栏目中，让我们一起回顾2015年度CRISPR/Cas9的重要进展;同时，我们还特别邀请了上海南方模式生物研究中心的技术顾问周效华老师对此进行进一步的阐释。

CRISPR/Cas9系统在医学领域大展身手

肿瘤

揭秘肿瘤的演化与转移

了解肿瘤基因组的主要挑战之一是难以区分乘客突变(或偶发突变，passengermutation)与驱动突变(drivermutation)。2015年3月，张锋等通过体内全基因组CRISPR/Cas9筛查，识别驱动肿瘤生长及肺转移的功能丧失突变，证明了以Cas9为基础的筛查可作为肿瘤演化过程中基因表型系统性分析的利器。研究还发现，基因组CRISPR/Cas9筛查亦可用于以下几个方面：在靶向治疗与免疫治疗中识别耐药基因，以及发现新的治疗靶点。构建结直肠癌模型

用含有干细胞巢蛋白的培养基，可以长期培养人与小鼠肠道干细胞。2015年4月，克利夫斯(HansClevers)等将CRISPR/Cas9技术用于体外培养人肠道干细胞，逐步引入最常见的4种人类结直肠癌(CRC)基因突变(APC、P53、KRAS和SMAD4)，构建了CRC类器官。研究发现，拥有四重突变的细胞不需要任何干细胞巢蛋白就能够生长，而且还能耐受抑癌药物nutlin-3。之后，将这些细胞经异种移植至小鼠体内，长出了有浸润癌特征的CRC。该研究的CRC进展模型通过改变培养基组分，筛选出功能性突变，比之前的所有其他体外人CRC模型更能反映人体内的情况。技术突破

CRISPR/Cas9系统可以构建出多个基因精确突变的小鼠，但其效率仅0.5%~20%，阻碍了生成足够数量的转基因小鼠来建立人类疾病模型。2015年5月，日本学者通过添加抗癌药物Scr7到遗传编辑的受精卵中，将CRISPR/Cas9系统的效率显著提高了19倍。

Cas9酶是基因编辑系统中一个非常关键的组成部分，而脱靶效应一直是CRISPR技术需要克服的重大技术问题。在任何临床应用之前，医生和监管机构必须确保Cas9酶不会引起非目标基因组的损伤。2015年，张锋等构建了3个新版本的Cas9酶，显著减少脱靶效应。

感染性疾病

根除HIV感染

2015年3月，一项研究通过设计与人类免疫缺陷病毒(HIV)特异性位点结合的向导RNA(gRNA)，引导CRISPR/Cas9系统使HIVDNA双链断裂。结果显示，人体18%~72%细胞内HIV病毒失活[NatCommun2015,10(6)：6413]。该研究解决了当前HIV药物无法真正清除隐藏在细胞DNA中病毒拷贝的问题，成功地使活化的、全长HIV于人体细胞内失活。2015年12月的另一项研究则通过短导RNA(sgRNA)，诱导被HIV感染的人类细胞表达所缺乏的因子(APOBEC3G和APOBEC3B)，从而抑制细胞内缺陷性HIV-1复制及野生型HIV-1传染。这两项研究为临床治疗HIV感染提供了不同的新治疗策略。

阻断疟疾传播

2015年11月，《美国国家科学院院刊》(PNAS)发表的一篇研究中，研究者通过CRISPR/Cas9系统实现抗虫基因在蚊子群体的繁衍，从根源上有效阻止疟疾的传播。相比于过去的研究，CRISPR/Cas9技术的优势在于，改造过的突变蚊子繁衍的后代约99.5%都会携带有抗虫基因。美国加州大学阿

特金森教授(PeterAtkinson)说，“如果在野外试验也能证明这种基因能降低蚊子携带疟原虫的能力，那么该技术将会成为控制疟疾的一个重要工具，因此，它将是这个领域一个非常重大的进展”。

遗传性疾病

治疗镰状细胞病

2015年9月，张锋等通过CRISPR/Cas9系统删除人造血干细胞中分子开关BCL11A的红系增强子，影响BCL11A表达;使造血干细胞成熟后，胎儿血红蛋白明显增加，以此对抗镰状细胞突变效应。奥尔金(StuartOrkin)评论道，“修复镰状细胞突变虽是最直接的治疗方式，但会引发造血干细胞抵抗遗传修复。而该研究的数据证明了在造血干细胞中靶向编辑BCL11A的增强子，是治疗镰状细胞病的一种全新的又有吸引力的方法”。

改善杜氏肌营养不良

导入CRISPR/Cas9系统治疗杜氏肌营养不良(DMD)因肌萎缩蛋白cDNA过于庞大而无法实现。2015年12月，《科学》(Science)杂志在线发表了3项研究，均通过非致病性腺相关病毒(AAV)成功将CRISPR/Cas9系统传递进DMD模型小鼠细胞内，移除肌萎缩蛋白基因23号外显子后，部分恢复了骨骼肌和心肌萎缩蛋白的功能，改善了肌肉生化、增强了肌肉力量。该研究标志着在完全发育的活体哺乳动物中，CRISPR/Cas9系统提供的一种有潜力转化为人类疗法的策略，成功治疗了一种遗传疾病。

人血白蛋白及异种器官移植

缓解白蛋白短缺/重燃器官移植希望

2015年11月，我国学者通过CRISPR/Cas9系统将人白蛋白cDNA敲入猪白蛋白基因位点，使试验中的仔猪均产生了重组人血清白蛋白(rHSA)

[SciRep2015,10(5)：16705]。该研究使利用猪和其他家养动物生产生物医药产品成为可能。同年11月的另一项研究，通过CRISPR/Cas9系统，成功根除了1个猪肾上皮细胞系(PK15)的所有猪内源性逆转录病毒(PERV);消除了将猪的器官用于人体移植的潜在威胁，解决了猪器官用于人体移植的重大难题，为全世界亟须器官移植的上百万患者带来希望。

肥胖与衰老

构建衰老研究模型/逆转肥胖

衰老是人体病理学第一危险因素，研究衰老的主要挑战是当前脊椎动物模型寿命相当长。2015年2

月，一项美国研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建出可在自然短寿的非洲青鱼中研究衰老的平台[Cell

2015,160(5)：1013]。该平台为系统性研究衰老与长寿提供了一个全新的模型，也可用于模拟复杂的人类疾病、特

征及药物反应。同年8月，克劳斯尼策(MelinaClaussnitzer)等研究发现了一条涉及ARID5B、rs1421085、IRX3和IRX5的脂肪细胞产热调节通路;通过使用CRISPR/Cas9系统调控该通路，可产生增肥与减肥效应[NEnglJMed2015,373(10)：895]。

■专家视点

CRISPR/Cas9系统是洪水猛兽，还是势不可挡的历史潮流?

历史上，核武器、克隆人、试管婴儿都曾引起伦理学争议。对于基因编辑(尤其是对生殖细胞的基因编辑)，学界普遍担忧其应用会超出伦理学所允许的范围。即其将不止用于消除疾病，而是会逐渐渗透到消除残疾和小毛病，甚至被用于改变外在容貌，或进行各种机体功能强化……最终导向“定制婴儿”。

2015年1月，CRISPR技术创始人之一的Doudna和其他17位学者一起在美国加利福尼亚纳帕谷召开会议，敦促全球科学界现阶段避免使用任何基因编辑工具来改造人类胚胎用于临床研究。2015年4月，美国国立卫生研究院(NIH)主席科林斯(FrancisCollins)发表声明，“NIH不资助任何企图将基因改变技术用于人类胚胎的研究。对人类胚胎进行基因编辑，几乎已被普遍认为是绝不可逾越的底线”。

因此，同年中国学者利用CRISPR/Cas9系统，对人类胚胎中与β地中海贫血相关基因进行编辑的研究，迅速引发了争议风暴。事实上，该研究只是在人类非正常受精卵废弃胚胎上进行，整个技术的运用与小鼠研究中基本一致。然而，争论并不能阻挡研究者的步伐。英国伦敦弗朗西斯克里克机构所组成的团队，已获得英国人类受精与胚胎管理局(HEFA)审核通过，等研究伦理审核批准后，即将开始编辑体外受精(IVF)的胚胎基因，来了解一个健康的人类胚胎如何发育，为治疗不孕症提供帮助。该研究很可能制造出第一个基因改造人类胚胎，其也使关于基因编辑的争论更加激烈。

关于基因编辑的伦理学争议仍会继续下去，这是人类对于未知事物恐惧的自然反应。它的危险也许真如洪水猛兽，但历史潮流无可阻挡。在此情况下，一味指责并无益处;认真思考，制定出合理的规范才是真理。对于基因编辑技术，我们最为需要的，是制定出合理而完善的规范，使其发挥强大的效用造福于人类。――上海南方模式生物研究中心周效华