人体皮肤表面有数以百万计的汗腺，发汗是调节体温的主要方式。汗腺细胞分泌的汗液除含大量水分外，还含有乳酸盐、尿素、钠、钾、抗菌肽和分泌型IgA等物质，在保持皮肤湿润和维持皮肤防御功能方面有重要作用。此外，汗腺细胞还对创面愈合具有重要作用，有研究表明创缘汗腺细胞参与了创面的上皮化进程。但汗腺受损后自身再生能力十分有限，在皮肤遭受全层大面积创伤时，由于瘢痕增生不能再生汗腺，将导致患者排汗功能障碍，严重影响患者生活质量，甚至危及患者生命。近年来在全层皮肤再生的多项研究中，毛囊和皮脂腺均已实现再生，但是汗腺再生并未实现。因此，研究汗腺再生对于创伤后皮肤功能性修复具有重大科学意义。

笔者课题组的研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSC)、脐带间充质干细胞(UCMSC)等在体外诱导条件下可以分化为汗腺细胞。然而，现存诱导分化方式均存在干细胞跨谱系转分化所致的诱导效率低以及异源性细胞可能存在的移植排斥等问题。通过转基因方法在一定程度上可提升干细胞诱导效率，但技术复杂，且存在外源性基因导入的风险，远期安全性仍不得而知。因此，建立新一代安全、高效的汗腺再生策略，是目前汗腺再生基础研究领域亟待解决的关键问题。

有研究表明，微环境在细胞分化过程中发挥重要作用，如胚胎发育微环境是决定成体干细胞终生保留干性的因素。上皮干细胞和汗腺干细胞均易受微环境调控的影响，即将它们移植至不同部位可以生成相应的组织。因此，体外构建微环境是诱导细胞分化的一种有效手段。由于微环境是一种立体三维环境，组成具有多样性与复杂性，体外构建微环境需要克服许多障碍，三维生物打印技术被认为是解决这一难题的主要手段。目前认为体外三维环境影响细胞分化的因素包括打印结构与生物墨水中的细胞因子，本文综述了这2个因素诱导汗腺再生的研究。

1　汗腺再生研究进展

目前，BMSC是汗腺再生研究领域使用最多的干细胞。其优点主要包括：低免疫原性;存在于骨髓基质，在大面积创/烧伤时受到外界影响较小;储存量较大，容易获取。Li等观察到，BMSC与热休克汗腺细胞共培养，可以直接分化为汗腺样细胞，将其移植到裸鼠体内可实现汗腺再生。但是，利用BMSC再生汗腺也存在对患者创伤较大、体外诱导耗费时间长等不足。与BMSC相比，人类UCMSC具有更高的增殖活性和更低的免疫原性，在一定条件下可分化为多种功能细胞。Xu等观察到，在体外培养条件下添加角质形成细胞生长因子可使UCMSC分化为汗腺样细胞，并表达汗腺细胞标志物。此外，Liang等利用人类汗腺细胞条件培养基使羊水干细胞分化为汗腺样细胞，并发现音猬因子(Sonic hedgehog)在诱导分化过程中发挥重要作用。Zhao等观察到在Fb中过表达NF-κB与Lef-1可将Fb重编程为汗腺细胞。虽然后几种方法亦成功实现了体外诱导汗腺细胞生成，但是在临床应用方面尚存在安全性较差和分化效率低等不足。

2　微环境影响汗腺细胞分化的研究

汗腺相关的微环境主要包括相邻的细胞、ECM中的糖胺聚糖、黏着蛋白及结构性蛋白、各种可溶性因子。研究表明，细胞微环境在调控细胞定位、细胞行为和细胞分化方面发挥着重要作用。为了观察特征性微环境对细胞命运的影响，Ferraris等将角膜上皮干细胞分别与胚胎期小鼠足部真皮、上唇真皮、背部真皮进行联合培养，结果显示与足部真皮共培养的细胞表达汗腺特征性标志物角蛋白9，与背部真皮共培养的细胞形成毛囊形态并表达毛囊特征性标志物角蛋白15，而与上唇真皮共培养的细胞则分化为具有多层结构的表皮。Lu等将汗腺祖细胞移植到小鼠乳腺脂肪垫，观察到部分细胞形成乳腺分支导管样形态，同时出现钠钾通道蛋白表达降低和乳汁蛋白表达增高;将汗腺祖细胞移植到小鼠背部皮肤，则形成分层的表皮;将汗腺祖细胞移植到小鼠肩部脂肪垫后，能形成卷曲的管状形态并表达汗腺特征性标志物角蛋白18。由此可见，干细胞所处的微环境对它的分化方向选择起决定性作用。大面积创伤患者，经过皮肤移植治疗后尽管皮肤损伤得到修复，但是汗腺不能再生，而微环境的改变可能是汗腺不能生成的原因。就小鼠而言，其足趾垫部位的上皮干细胞分化形成汗腺组织，而背部的上皮干细胞则分化形成毛囊与皮脂腺，这种汗腺分布方式为研究微环境对细胞分化的影响提供了良好模型。

3　三维生物打印技术用于再生医学领域

三维生物打印技术是一种将计算机辅助设计、计算机辅助制造、计算机数控、精密伺服驱动、生物材料、细胞生物学和分子生物学等学科与技术集于一体的综合性应用技术。细胞三维生物打印技术为组织器官修复提供了一项全新的临床医学技术，同时也为再生医学、组织工程、干细胞、癌症等研究领域提供了非常好的研究工具。Pati等将心肌组织、软骨组织的ADM制成生物墨水，通过三维生物打印技术构建体外三维结构，成功诱导脂肪间充质干细胞表达心肌细胞、软骨细胞的特征性标志物。Lee等通过构建可以持续释放多种生长因子的三维打印支架，诱导内源性间充质干细胞在体内分化形成半月板，成功治疗半月板受损的绵羊。以上研究充分证明，三维生物打印技术在模拟微环境诱导干细胞分化以及促进组织再生方面具有巨大潜力。

4　三维生物打印微环境诱导汗腺再生

4.1　体外模拟微环境诱导表皮干细胞向汗腺细胞分化

汗腺来源于胚胎期的表皮干细胞，因此表皮干细胞被认为是汗腺再生良好的种子细胞。笔者课题组以明胶和海藻酸钠作为体外微环境构建的生物材料支架(结构因素)，将小鼠足趾垫匀浆液(小鼠背部真皮匀浆液作为对照)和EGF添加至配制好的生物墨水(生化因素)中，然后与来源于背部的表皮干细胞混合，采用三维生物打印技术以设定好的模型进行打印。培养14 d，于显微镜下观察到添加足趾垫匀浆液的生物墨水打印的微环境能培养出汗腺样细胞，免疫荧光检测显示有汗腺特异标志物(角蛋白8、角蛋白18)表达;添加背部真皮匀浆液的生物墨水打印的微环境则无此现象。将上述携带有汗腺样细胞的组织替代物移植到足趾垫烧伤小鼠模型，可观察到汗腺组织修复和发汗功能部分恢复(图1)。常规培养方式下单一的EGF不能诱导细胞分化，细胞增殖和分化效率低。微环境是复杂的、多样的，组织匀浆为细胞分化提供了复合的诱导性生长因子，生物材料支架为细胞分化提供了结构空间和附着位点，三维生物打印模型为精准诱导细胞定向分化提供了可行性并促进细胞增殖和基质分泌，诱导2周后细胞分化效率超过50%。这种方法不需要考虑成瘤和外基因摄入等问题，诱导时间大大缩短且满足临床汗腺缺失所需要的细胞补给量，具体有关分子机制还需要进一步研究。

4.2　微环境结构因素对汗腺再生的影响

在证明三维生物打印微环境可以诱导汗腺细胞分化的基础上，笔者团队进一步研究了结构因素在此过程中的作用[20]。生物材料支架及生物墨水制备同前，使用直径300、400 μm的打印喷嘴打印形成具有不同孔径的三维结构，分别命名为300 μm组[孔径为(1.4±0.1)mm]和400 μm组[孔径为(1.1±0.1)mm]。见图2。2组三维结构中细胞活性和增殖能力无明显差异，但是与400 μm组的三维结构比较，300 μm组的三维结构降解速度较慢。培养1～7 d，300 μm组的三维结构释放BMP4因子质量浓度(28.3 pg/mL)高于400 μm组的三维结构(21.1 pg/mL);培养14 d则反之，前者为16.3 pg/mL、后者为19.5 pg/mL。培养5 d，300 μm组的三维结构中可检测到汗腺标志物(角蛋白18、角蛋白19)表达，400 μm组的三维结构则无此现象。此外，将有汗腺形态发生的组织块移至常规培养皿后，组织形态消失、细胞贴壁生长。上述研究结果表明，300 μm直径打印喷嘴打印形成三维结构的孔径和几何参数更有利于细胞分化和形态发生，这可能与其孔径和几何参数提供了适宜浓度的营养因子和利于汗腺形态发生的空间有关。

图2 300 μm和400 μm打印喷嘴打印的三维结构。2A.肉眼下，300 μm打印喷嘴打印的三维结构;2B.300 μm打印喷嘴打印的三维结构的孔径、结构柱宽度　光学显微镜×100，图中标尺为500 μm;2C.肉眼下，400 μm打印喷嘴打印的三维结构;2D.400 μm打印喷嘴打印的三维结构，孔径小于图2B、结构柱的宽度大于图2B　光学显微镜×100，图中标尺为500 μm

5　结语

越来越多的研究表明，微环境对于细胞、组织、器官乃至整个机体的重要性，但是目前将微环境因素与组织器官修复手段相结合的理论还不完善。笔者团队采用三维生物打印技术和ADM匀浆(即前述的小鼠足趾垫匀浆液)在体外模拟汗腺发生微环境诱导汗腺再生，证明微环境结构因素和生化因素在维持和驱动组织发生方面都有重要作用，为体外构建器官提供了新的思路和技术方案，促进了创伤修复与组织再生学科的发展。