唇腭裂是最常见的先天性颅面出生缺陷，全球平均发病率约为1/600-700，给患者及家属造成深刻的心理困扰，对患者家庭及社会造成巨大的经济负担。唇腭裂的发生和发展是多阶段、多因素参与的过程，是环境和遗传因素共同作用的结果。流行病学研究发现，与唇腭裂相关的环境因素主要包括：孕妇早期主动或被动吸烟、饮酒、维生素缺乏、病毒感染、服用某些药物、接触有毒有害及放射物质等;受影响的婴儿常由于早产、呼吸道疾病以及中枢神经系统疾病而导致死亡，而受影响的成年人增加了心脏疾病、癫痫和各种癌症的风险。

随着基因检测技术的发展及对疾病认识的提高，通过系谱分析等研究证实唇腭裂的遗传度达到70%，已有多个与疾病发生相关的基因被发现，如染色体1q32、2p13、17q21，易感基因IRF6、VAX1、FGFR2等。然而这些易感基因或者位点如何被调控，又是通过何种途径作用于细胞层面介导唇腭裂的发生，目前尚未有明确的报道。有研究报道，microRNA(miRNA)活性的破坏可能在这些畸形的发生中起作用。

外泌体作为miRNA的一个重要载体，其中包含来自亲本细胞的特定分子和抗原子集，越来越多的证据表明外泌体可以作为生物标志物，认为唇腭裂患者血清外泌体中包含与疾病状态和治疗性有关的独特遗传信息。本文就细胞外泌体在唇腭裂领域的研究进展综述如下。

1.外泌体(Exosome)概述

外泌体是细胞内源性小囊泡，大多数活细胞均可分泌，由磷脂双分子组成，直径40～100 nm，密度1.10～1.18g/mL。它们通过细胞外膜出芽而释放，以响应细胞活化或细胞凋亡，在正常及疾病状态下作为一种调节剂在细胞间通讯起关键作用。当用电子显微镜观察时，显示出特征性的杯状形态，表现为扁平球体。杯状形态可能起源于传统电子显微镜的样品制备过程，在此过程中因极度脱水从而导致外泌体塌陷。相反，外泌体在低温电子显微镜检查中保持完全水合，可观察到圆形的形态。

为了解外泌体的细胞组成，已经使用了包括胰蛋白酶消化、质谱、蛋白质印迹和荧光激活细胞分选(FACS)等多种技术。外泌体中含有多种蛋白，如膜转运蛋白、融合蛋白、tetraspannins、热休克蛋白、涉及多泡体生物发生的蛋白、脂质相关蛋白和磷脂酶。有研究表明，外泌体中的蛋白大多数都是保守的。由抗原呈递细胞(APC)释放的外泌体富含抗原提呈蛋白，如MHC I类和II类。

来自树突状细胞的外泌体含有CD86，是一种重要的T细胞共刺激分子。除了形态特征外，外泌体的蛋白质和脂质组成是独特的，为其鉴定提供了另外的方向。此外，外泌体在胆固醇、神经酰胺或其他鞘脂类以及具有长且饱和脂肪酰基链的磷酸甘油酯的富集中是独特的。

研究显示，来自肥大细胞和树突状细胞的外泌体中磷脂酰乙醇胺的水平增加，在外泌体双分子层的两个小叶之间翻转的比率高于细胞膜。外泌体的外表面还含有糖基团，其富含甘露糖、聚乳糖胺、α-2,6唾液酸和复杂的N-连接聚糖。外泌体含有多种天然“货物”分子，并通过循环将这些功能性“货物”转移到相邻的细胞或更远的细胞，然后影响不同的信号通路。由于其稳定性高、生物相容性好、低免疫原性和毒性的特点，外泌体已经引起研究者的关注，或可成为疾病诊断治疗的潜在有效方式。

近年来，许多学者为探索外泌体在不同病理生理状态下的调节作用进行了大量研究，如癌症、免疫紊乱和不同器官的其他系统疾病中的作用。此外，最近的研究叙述了干细胞来源的外泌体在治疗干预和组织修复中的影响。由于外泌体能够转移蛋白质、脂质和核酸，它们可以影响受体和亲本细胞的各种生理和病理功能。

2.外泌体与microRNA

外泌体携带的一个关键“货物”是核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)，编码和非编码核糖核酸(RNA)，如信使RNA(mRNA)和微小RNA(miRNA)。这些核酸通常需要在外泌体分离后精确定量，它们的图谱精确地反映了多种医学病症和疾病。Mittelbrunn等发现外泌体内部所含RNA与其母细胞不同，其主要受外界刺激的影响。同样，外泌体含有大量参与疾病发生的miRNA。

为了研究外泌体运输所介导的细胞通讯，就需要对外泌体中miRNA进行深入研究，明确miRNA的分子组成及调控机制。miRNA是含有大约22个核苷酸的RNA，通过控制转录后基因表达来调控胚胎发育。越来越多的证据支持miRNA在脊椎动物和哺乳动物颅面发育中的重要性。基因工程小鼠模型的研究已经产生了对各种人类疾病的重要见解，并为研究致病过程的复杂分子和遗传因素提供了新的机会。miRNA除了参与调节转录、翻译和细胞信号传递过程的非规范机制之外，还通过抑制转录或促进靶mRNA的降解来调节基因表达。

细胞外分泌的miRNA或与特定的蛋白质复合，或封装在称为外泌体的微囊泡中，作为细胞间通讯在细胞之间转运。循环中的分泌miRNA在递送至受体细胞后保持功能，调节靶基因及其相应的信号传导途径。癌细胞分泌的miRNA介导的细胞间通讯，影响与疾病相关的生理过程，如血管生成、代谢重编程、免疫调节、转移和化学耐受性。

鉴于体液中miRNA的稳定性及其在解除癌症相关遗传途径中的良好记录作用，人们有意将分泌性miRNA作为用于检测、诊断和预测癌症的液体活检生物标志物来开发。在哺乳动物中，miRNA编码序列占基因组约1%，并且超过60%的蛋白质编码基因受miRNA调控。数据显示，人类基因组可编码约3000个特异miRNA，这些小的非编码RNA在人类健康中发挥着至关重要的作用，从调节发育和分化到参与疾病，如癌症、心血管疾病、唇腭裂等。因此，对miRNA生物学的全面了解，与人类生理学和疾病病理学密切相关。

鉴于此，从基础科学和临床转化科学的角度来看，在组织和体液中表征miRNA仍然是生物学领域的一个活跃的研究领域。已证实miRNA在多种体液中以稳定的无细胞形式循环，这些miRNA水平的改变与多种人类疾病的发生有关。因此，研究循环miRNA作为“液体活组织检查”生物标志物检测和诊断癌症和其他疾病的潜在效用具有重大意义。考虑到miRNA在复杂的遗传网络中充当“节点”调节因子，体液活检中生物标志物水平的改变对反映疾病的失调基因提供大量的信息。

在细胞间通讯过程中，外泌体包裹的miRNA靶向受体细胞并调节来自器官内及远处的信号传导，这种现象已经在生理环境和各种疾病中得到了验证。Xie等通过使用来自两种肾脏疾病动物模型(第5/6部分肾切除术(PNx))和双肾单夹(2K1C)模型的血浆和血浆来源的外泌体样品进行miRNA分析，发现血浆中的总miRNA表达水平高于血浆来源的外泌体，此外研究人员还发现了在外泌体内选择性富集的miRNA，这表明在这些疾病条件下血浆和血浆衍生的外泌体中的miRNA被差异调节。

在总体血液中，由于物质背景复杂使miRNA表达水平的改变被掩盖，因此血浆miRNA检测不能代替外泌体miRNA检测。据估计，约90%的miRNA与蛋白质存在于微囊泡，尽管这些蛋白质复合物中miRNA的生物学和临床意义尚不清楚，但这些复合物可能保护miRNA不被体液所降解。考虑到miRNA的稳定性、miRNA在调节基因表达中的作用以及改变的miRNA水平与多种人类恶性肿瘤的关联，外泌体中miRNA表达成为许多学者近来研究的热门方向。

由于体液如血浆、血清、尿液、囊液等的液体活检的微创性质，这些样本中的分泌miRNA谱分析有利于研究唇腭裂与外泌体miRNA之间的相关性。偶有报道由于不同群体分析相同唇腭裂类型的miRNA谱不一致，这些不一致可能反映了样品采集和储存的标准操作程序的差异，以及分析方法和用于测定的数据标准化技术的不同。在此背景下，我们将讨论miRNA在疾病中的生物发生、分泌和功能具有显著意义，开发强大且可重复的miRNA液体活检检测是目前所需要解决的技术难题。

3.miRNA与唇腭裂

与良、恶性肿瘤不同，唇腭裂患者的体液与正常对照相比外泌体水平未见明显增高，但唇腭裂患者的血浆外泌体中miRNA的表达水平有明显的改变。研究发现，miRNA可作用于细胞信号通路中下游的调控因子，通过调控相关蛋白，以信号级联放大、通路间的交互作用及通路网络的鲁棒性3种调节方式影响细胞信号的传导。

在腭裂方面，也得到的很好的诠释：在腭的发育过程中转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)和Wnt是重要调控分子，二者分子量改变均可导致腭裂的发生，同时Wnt可通过调节TGF-β表达而影响腭的融合;miRNA-140可作用于血小板源性的生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)信号通路，影响腭部的形成，同时miRNA-140可抑制信号分子shha的表达;BMP(bonemorphogenetic protein)信号通路中，下游Smad可调控miR-17-92基因簇的表达，同时miR-17-92可进一步作用于TGF-β信号通路;在TGF-β信号通路中，miRNA-200基因可以抑制其下游的信号传导，同样TGF-β通路可以通过增加miRNA200的甲基化水平，抑制其表达，从而避免腭裂的产生，这种网络调节模式，在一定程度上减低外界变化对细胞内外各种生物过程的影响。

Dandan Li等研究发现成纤维细胞生长因子(FGF)的miRNA结合位点单核苷酸多态性(SNPs)与FGFR基因可能影响miRNA与mRNA的作用方式，亦与非综合征性唇腭裂易感性密切相关。Zou等通过分析唇腭裂患者血浆来源的miRNA的表达发现血浆中的miR-16-2-3p，miR-365a-3p and miR-877-5p较对照组高表达，其可能作为一组诊断唇腭裂的标记物，这些miRNA的失调亦可能参与唇腭裂的进展。

李曼达等在研究中发现hsa-miR-3611对应靶基因GABRB3表达降低时会导致唇腭裂，而唇腭裂患儿中hsamiR-3611表达下调，说明hsa-miR-3611对靶基因GABRB3起到正向调节作用。Homanics等通过基因敲除发现当小鼠敲除GABRB3基因后约57%(40/70)的小鼠发生腭裂。GABRB3是GABA受体β亚单位，是GABA受体的主要组成部分。GABA在胎儿颌面发育中起重要作用，其可促使胚胎神经元生长、分化，当改变GABA信号时，可干扰腭的正常发育。另外，hsa-miR-764对应靶基因F13A1与唇腭裂相关，但具体机制尚未研究。

还有研究表明miRNA-29可部分抑制TGF-β1诱导的胶原蛋白Ⅰ的表达，而胶原蛋白是细胞外最主要的基质成分。由此可见miRNA-29可通过对TGF-β的调控和唇腭裂的发生相关。

4.展望

外泌体近年来受到极大的关注，因为外泌体的生物指纹实际上反映了它们起源的亲本细胞的指纹。尽管外泌体的确切生物学功能尚未完全解读，但越来越多的证据表明，外泌体在许多细胞过程中起着至关重要的作用，如细胞间通讯、凝血、抗原呈递以及废物管理。原来被认为是实验的人工制品，废弃物或已故细胞的遗体，现在认为外泌体是细胞间通讯新形式的核心部分。

细胞间通讯在所有多细胞生物体中至关重要，以前认为只有通过接触性依赖(相邻细胞之间的直接接触)、旁分泌(附近细胞受体上短程信号分子的结合)、内分泌(通过血流结合远处细胞上的远程激素)或神经元(沿神经元传播的电脉冲)传递信号。最近的研究表明了许多过程中由外泌体介导细胞-细胞通讯，例如免疫信号传导、血管发生、衰老、细胞增殖、分化，并参与许多人类疾病如唇腭裂、癌症和艾滋病。更重要的是，越来越多的证据表明外泌体通过调节血管生成、免疫和转移在促进肿瘤发生中起关键作用。

在体液和血液中循环的外泌体，特别是潜在的非侵入性或微创生物标志物，可用于各种类型癌症的早期诊断和预后。因此，外泌体不仅有助于更好地理解细胞生理学和病理学，而且还有很大的潜力被各种临床应用，从诊断和预后到核酸递送和癌症治疗。为适应分子医学的快速发展，外泌体的研究开始慢慢演变，例如：在外泌体中发现诸如miRNA的遗传物质已经帮助形成了miRNA分析技术。

尽管如此，只有通过开发高效的外泌体分离纯化技术，外泌体研究领域才能有重大而有影响力的发现。外泌体发挥的关键作用是细胞间通讯,有助于塑造靶向药物递送和治疗的载体。外泌体生物标志物的异常水平可能与唇腭裂的发生具有相关性，作为一组有前途的生物标记物，对外泌体分子特异性的了解将有助于研究其致病作用及其作为早期检测唇腭裂的生物标志物，为唇腭裂的早期诊断和治疗提供新的途径。随着外泌体及其功能的完全解码，在将来的临床实践中将会有更多的外泌体应用。

来源：王俊伟,李玮,杨学财.外泌体在唇腭裂中的研究进展[J].全科 医学电子杂志,2019(04):16-18+21.