牙周病常与牙槽骨的吸收有关，并最终可能会导致牙齿脱落。十多年来，牙源性干细胞为再生牙体开辟了新的契机。牙囊细胞(dentalfolliclecells，DFCs)是一种牙源性干细胞，来源于外胚层间充质，参与牙的发育、萌出，并形成牙周组织。目前认为，其具有多向分化能力，可分化为牙周膜细胞、成牙骨质细胞及成骨细胞，继而形成牙周膜、牙骨质和牙槽骨，促进牙周组织结构和功能的修复。牙囊细胞的分化和功能受多种细胞内外信号分子的调控，是多种细胞和蛋白相互作用的结果。本文对牙囊细胞成骨分化的研究进展作一综述。

1.信号通路

信号通路的研究对于了解牙体组织的复杂性很有帮助。通过对骨髓间充质干细胞的体外研究，评估成骨分化期间信号通路的作用。此外，骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)信号通路、经典WNT(无翅型MMTV整合位点家族成员)信号通路和NOTCH信号通路对于牙囊细胞的成骨分化至关重要。下面将分别说明DFCs成骨分化期间BMP、WNT和NOTCH信号通路的作用。

1.1BMP信号通路

BMP是一种成骨生长因子，能促进异位成骨，与BMP受体1型和2型结合后形成典型的BMP信号通路。迄今，研究已发现20多种BMP家族成员，其生物学功能主要通过SMAD依赖性发挥作用。Viale等研究认为丝氨酸/苏氨酸受体激酶使细胞内蛋白SMAD1/5/8磷酸化，进入细胞核并诱导转录因子如DLX3或RUNX2的基因表达，从而调节BMP靶基因的转录。

Saugspier等研究认为典型成骨分化标志物RUNX2经BMP2诱导后表达上调，而BMP2诱导分化的大多数调节基因与成骨分化的生物学过程无关。吴艳等利用腺病毒感染的方式，使牙囊细胞过表达BMP9，经BMP9诱导后早期便表现出明显增强的碱性磷酸酶活性和钙盐沉积，随时间推移表现出持续增强的活性，这表明BMP9可迅速且持续的诱导牙囊细胞成骨向分化。在成骨分化过程中，BMP2不仅诱导BMP/SMAD通路，而且诱导DFCs中的WNT信号传导。因此，WNT信号在DFCs中的作用的研究是非常必要的。

1.2WNT信号通路

WNT信号通路分为经典和非经典两种形式。WNT信号通路在牙囊细胞成骨分化过程中扮演重要角色。β-catenin是WNT信号通路的关键。Du等采用免疫组化的方法比较大鼠下颌第一磨牙β-catenin的表达，证实WNT/β-catenin信号通路正向调节DFCs的成骨和成牙骨质向分化。Silverio等研究表明BMP2需要内源性WNT/β-catenin信号传导来促进细胞成熟。而经典WNT通路中的WNT3A诱导成骨标志物的表达并刺激BMP信号通路。

Si等研究显示WNT3A激活富含半胱氨酸61(CCN1/Cyr61)基因，促进成骨向分化。但当WNT3a的表达量增加时，间充质干细胞向成骨方向分化受到抑制。Viale等对 鳞状细胞癌细胞的对照细胞培养显示APCDD1抑制β-catenin和经典WNT/β-catenin通路的典型靶基因的表达。而以往的研究对非经典WNT的生物学意义知之甚少，Sakisaka等[通过免疫组织化学评估了小鼠牙根发育期间在成牙骨质细胞和牙囊细胞中表达WNT5A，得出WNT5A对于牙囊细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的表达起负调节作用，而WNT5a基因在牙囊细胞中的沉默表达导致WNT3a介导ALP表达增加的增强。这些发现提示在DFCs成骨分化过程中，经典和非经典WNT信号之间存在反馈机制。

Liu等研究表明WNT抑制剂DKK1通过阻断WNT/β-catenin信号通路抑制成骨分化。WNT信号通路的各种因子如何相互影响，其机制并未完全清楚，需要进一步研究。

1.3NOTCH信号通路

在人类细胞中，已知有4种不同的NOTCH蛋白，即跨膜受体。它们介导表达一种NOTCH受体或一种与膜结合的NOTCH配体如Jagged-1的相邻细胞的传递。NOTCH配体的结合触发γ分泌酶裂解NOTCH。NOTCH的胞内结构域易位至细胞核并激活靶基因的转录。对于间充质干细胞的分化，NOTCH信号起着重要的作用，它调节一系列生物进程。

NOTCH-1是人DFCs的一种标记物。成骨分化过程中DFCs全基因组表达谱揭示了与NOTCH信号通路相关的差异表达基因，NOTCH信号在DFCs中被激活。Viale等研究认为NOTCH信号通路的诱导不仅影响成骨分化，而且还影响BMP信号通路的激活和转录因子DLX3的表达，被激活的NOTCH信号通路通过负反馈回路调节DFCs的BMP2/DLX3定向分化。然而，Wang等研究表明，NOTCH信号通路能够上调成骨基因Runx2的表达从而促进BMP2成骨。因此，关于NOTCH在DFCs中的作用需要进一步的研究证实。

2.转录因子

在信号传导通路的下游，特定的转录因子参与调节成骨细胞的分化。

2.1TP53和SP1

在成骨分化过程中，超过35%的调控基因在启动子上具有转录因子TP53和SP1的结合位点。Felthaus等研究了SP1和TP53瞬时过表达后的DFCs，认为SP1影响DFCs的增殖，而TP53略促进成骨分化。然而，TP53和SP1的基因沉默对所研究的生物学过程没有影响。这表明TP53和SP1对DFCs的成骨分化起间接作用。TP53和SP1过度表达后，DFCs中的全基因组基因表达谱揭示了诸如细胞运动、伤口愈合和程序性细胞凋亡的生物过程。

Niger等研究显示转录因子Osterix的转录活性需要将SP1募集至骨钙素启动子上。Zhang等认为SP1在RUNX2的P1启动子上与富含嘌呤的DNA序列结合之后刺激成骨标记物RUNX2的表达。而He等研究发现当SP1刺激RUNX2的表达时，TP53抑制成骨转录因子RUNX2的表达和间充质干细胞的成骨分化。Despars等研究表明衰老过程中成骨分化潜能的丧失取决于TP53的表达。这些研究都表明TP53和SP1参与成骨分化，但还需要进一步的研究来揭示它们在DFCs成骨分化中的作用。

2.2ZBTB16

ZBTB家族(zincfingerandBTBdomainproteinfamily)是指一类在N末端含有BTB结构域和在C末端都含有多个锌指结构域的蛋白质。ZBTB16是其中的成员，参与不同的发育过程。Onizuka等认为ZBTB16基因沉默降低了ALP活性、抑制骨钙素、骨涎蛋白等成骨基因的表达。Viale-Bouroncle等、Felthaus等发现DFCs中与成骨分化相关的斯钙素的过度表达刺激了ZBTB16的表达，而ZBTB16诱导BMP2的表达并在DLX3启动子上具有结合位点。除此之外，还提出了ZBTB16的一种特异性途径，用于DFCs的成骨分化，该途径独立于RUNX2的表达，并且只能通过地塞米松诱导。ZBTB16作为Osterix的下游转录因子，可以用作成骨细胞分化的晚期标志物。ZBTB16直接结合到Osterix的启动子区域，但不与Runx2结合，诱导与成骨分化相关的基因。

Felthaus等发现ZBTB16的下调减弱了地塞米松诱导的分化，而通过地塞米松诱导上调的基因也被ZBTB16过表达上调。因此，ZBTB16有多种功能，需要进一步的研究来评估其在地塞米松诱导通路中对DFCs的成骨分化的特定作用。

2.3DLX3

以前的研究表明DLX3直接参与成骨细胞标志物的表达。DLX3在DFCs成骨分化过程中差异表达，而其他成骨转录因子如DLX5或RUNX2则不是高度诱导的，因此，DLX3在DFCs的分化中具有决定性的作用。Viale-Bouroncle等研究表明BMP2诱导DLX3的表达，且BMP2/DLX3正反馈回路促进DFCs的成骨分化，反之亦然。然而，在具有高浓度BMP2的细胞培养基中，DLX3的过表达不促进DFCs中的成骨分化并抑制内源性DLX3的表达。所以其他信号通路可能与BMP2/DLX3正反馈回路相互作用。

BMP2和DLX3均诱导DFCs中的经典WNT/β-catenin途径，而BMP2通过蛋白激酶A(PKA)激活β-catenin且促进LEF1/SMAD4/β-catenin复合物与DLX3启动子的结合。β-catennin的PKA依赖性激活对于DLX3的表达和成骨分化是至关重要的。相反，WNT3A抑制DFCs和DLX3的成骨分化。APCDD1是经典WNT通路的抑制剂，可由DFCs中的DLX3诱导。

有学者在2015年的研究发现DFCs中APCDD1的消耗抑制WNT信号传导途径和β-catenin的激活。此外，APCDD1的消耗降低了ALP活性从而阻止DLX3的表达以及DFCs的成骨分化。虽然DLX3在成骨分化中起决定性作用，但其实际的生物学效应和调控是未知的，仍需更多的探索。

2.4早期生长反应蛋白(earlygrowthreactionproteins，EGR)1

EGR1是众所周知的转录因子，由有丝分裂激活的PKA通路激活，并作为细胞生长和细胞分化等细胞过程的调节因子。此外，它在各种发育和组织伤口愈合过程中起重要作用，如血管，软骨和骨的愈合。Press等研究调查了在DFCs和根尖乳头干细胞的成骨分化中，EGR1的过度表达促进了DFCs的成骨分化。此外，尽管EGR1在成骨分化期间不改变BMP信号通路的激活，但EGR1的表达水平与成骨因子DLX3和BMP2的表达水平相关。这些研究结果表明EGR1通过BMP2/DLX3正反馈回路直接促进DFCs成骨分化。

3.细胞外基质蛋白

细胞外基质蛋白(extracellularmatrixproteins，ECMPS)对干细胞的增殖和分化起重要作用。研究表明，ECMPS诱导细胞内信号传导途径并调节成骨细胞的分化。本节总结了近年来关于ECMPS和整合蛋白对DFCs成骨分化影响的研究。

3.1层粘连蛋白

层粘连蛋白是一种能构成ECMPS结构的异三聚体多结构域家族类蛋白。这类ECMPS含有与细胞膜受体结合的生长因子样结构域，可以改变细胞内的信号通路，调节细胞过程。而整合蛋白是ECMPS的细胞膜受体，控制间充质干细胞的分化。Salasznyk等研究认为层粘连蛋白5结合整合素α3/β3并激活粘着斑激酶(FAK)/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号，诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化。有学者发现在成骨分化过程中，DFCs中的一些调节基因编码层粘连蛋白的ECMPS等。

层粘连蛋白高度诱导晚期成骨和成牙骨质标记物如骨桥蛋白的表达并刺激其矿化。Viale-Bouroncle等发现在DFCs的长期培养基中出现了层粘连蛋白的矿化结节，但没有诱发因子。

3.2Ⅰ型胶原蛋白

Morsczeck等认为Ⅰ型胶原蛋白不仅是矿化组织的主要部分，而且还涉及DFCs成骨分化过程中的分子过程。在人DFCs中，Ⅰ型胶原诱导成骨分化过程中成骨标志物的表达。Viale-Bouroncle等研究表明不同的信号通路分别调节早期成骨标志物(ALP)和晚期成骨标志物(骨桥蛋白)。在DFCs中FAK的抑制抑制了成骨标志物的表达。Salasznyk等认为FAK/ERK信号通路对于诱导不同种类间充质干细胞的分化至关重要，然而，Ⅰ型胶原蛋白在DFCs中独立于FAK激活ERK。尽管FAK的激活是诱导早期成骨标志物ALP的必要条件，但ERK的激活对于晚期标志物如OPN的表达是必需的。

4.结论

最近的研究使人们对DFCs中成骨分化的分子过程有了更深入的了解。BMP信号通路和转录因子DLX3是成骨分化过程中的关键因素，而BMP2/DLX3反馈通路则是一个中心过程。它与其他信号通路如NOTCH信号通路的关系有着较为复杂的机制。此外，NOTCH，WNT或BMP等对成骨分化影响的其他研究也是必要的。这些新的结果不仅有助于研究更复杂的BMP2/DLX3反馈回路途径，而且还将揭示DFCs中成骨分化的其他新途径。

来源：杨爽,胡伟平.牙囊细胞成骨分化的研究进展[J]. 医学,2018,38(10):930-933+946.