【摘要】

目的研究乳牙牙本质中的基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)在乳牙牙本质胶原降解中的作用。

方法将滞留原因拔除的正常乳牙制备为牙本质粉后分为3组，分别为空白组、醋酸氯己定组(MMPs抑制剂)和CMT-3(6-去甲基-6-脱氧-4-去二甲氨基四环素，chemically modified tetracycline-3)组(MMPs抑制剂)。每组6份标本，每份标本50.0mg。各组标本进行pH循环，每次循环置于脱矿液中6小时，人工唾液中18小时，共7次。醋酸氯己定组和CMT-3组的脱矿液和人工唾液中分别加入0.2%醋酸氯己定和0.02%CMT-3。收集各组的脱矿液和人工唾液上清，用羟脯氨酸酶联免疫试剂盒分别检测各组脱矿液和人工唾液上清中的胶原降解量。

结果空白组的脱矿液和人工唾液上清中的胶原降解量均高于醋酸氯己定组和CMT-3组，差异有统计学意义(P <0.05)。醋酸氯己定组和CMT-3组的胶原降解量差异无统计学意义(P >0.05)。结论 乳牙牙本质中的MMPs活化后可以降解自身牙本质胶原，使用MMPs抑制剂可以抑制牙本质胶原的降解。

【关键词】基质金属蛋白酶;牙本质;胶原降解

基质金属蛋白酶家族(Matrix Metalloproteinases，MMPs)是一类内源性多肽酶，在体内可降解细胞外基质，包括各种天然和变性形式的胶原[1]。目前已证实人牙本质中存在多种MMPs[2,3],龋坏牙本质中的MMPs含量增高，推测其可在龋病的胶原降解过程中起作用[4]。乳牙与恒牙相比有机质含量高，矿化程度低，故胶原降解是乳牙龋病发展中的重要过程。目前有关乳牙牙本质中MMPs的存在情况及与牙本质胶原降解关系的研究较少。此前我们已通过免疫组化实验证明MMPs存在于乳牙牙本质中[5]。本实验拟建立体外的pH循环模型，通过脱矿液和人工唾液对牙粉的的交替作用，来模拟口内菌斑下牙齿微环境中pH的变化，观察乳牙牙本质中的MMPs对自身牙本质胶原的降解作用。实验以MMPs抑制剂醋酸氯己定和6-去甲基-6-脱氧-4-去二甲氨基四环素(chemically modified tetracycline-3，CMT-3)进行对比，观察MMPs抑制剂对胶原降解的影响，探讨使用MMPs抑制剂抑制龋病发展的可能性。

材料和方法

1 实验试剂

HEPES缓冲试剂(北京原平生物技术有限公司);醋酸氯己定(锦州九泰药业公司);蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich，美国);CMT-3(Sigma-Aldrich，美国);人羟脯氨酸酶联免疫分析试剂盒(R&D Systems，美国)

2 实验仪器

ZDM-100振动碾磨机(天津科器高新技术公司);BSA124S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);Plus384多功能酶标仪(SPECTRAmax，美国)

3 样本制备

牙粉的制备：家长知情同意，选取因滞留拔除的正常乳牙60颗，即刻去除牙釉质、牙骨质及牙髓，-70℃保存。所有标本在液氮冷却条件下，碾磨机研磨成粉，冷冻干燥。过筛，选取70～180目的牙粉，4℃保存备用。

配制脱矿液与人工唾液：脱矿液为50mmoL/L醋酸，22mmoL/L CaCl2，2.2mmoL/L Na2HPO4和蛋白酶抑制剂混合物，pH5.0[6]。人工唾液成分为30mmol/L KCl，20mmol/L HEPES，4mmol/L KH2PO4，0.7mmol/L CaCl2，0.2mmol/L MgCl2·6H2O和蛋白酶抑制剂混合物，pH7.4[6]。

实验分组：将制备的牙粉分为空白组、醋酸氯己定组和CMT-3组，每组牙粉300.0mg。各组的牙粉再等分为6份，每份50.0mg。具体分组及各组处理见表1。

4 实验步骤

pH循环步骤见图1。空白组：脱矿液1ml，37℃水浴震荡6h，离心(10000r/min)10min，收集脱矿液上清0.97ml;人工唾液1ml，37℃水浴震荡18h，离心10min，收集人工唾液上清0.97ml。醋酸氯己定组：脱矿液和人工唾液中含0.2%醋酸氯己定，其余步骤同空白组。CMT-3组：脱矿液和人工唾液中含0.02%CMT-3，其余步骤同空白组。

各组重复以上pH循环7次后，每份牙粉收集到脱矿液和人工唾液各1份，均为6.79ml。18份牙粉共收集到液体样品36份。

5 各组标本胶原降解量的检测

胶原含量标准曲线的制备：在酶标包被板上设标准孔10孔，每2孔一组，将试剂盒中的胶原标准样品稀释为5个浓度，分别为30ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml

各组样品中胶原降解量的检测：设空白孔及待测样品孔。1份样品分别设2个待测样品孔，取均值。36份样品共设72个待测样品孔。每孔样品按说明书被样品稀释液稀释5倍。

温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

洗涤：每孔加满洗涤液，静置30s弃去，重复5次。

加酶：每孔加入酶标试剂，空白孔除外。

温育，洗涤。

避光显色15min，终止反应。

空白孔调零，Plus384多功能酶标仪测量OD450的各孔吸光度(OD值)，于终止反应15min内进行。

根据标准曲线测定出各样品中羟脯氨酸的含量,换算为胶原降解量[7]。

6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，分别比较各组脱矿液和人工唾液上清中胶原降解量的差异。

结 果

各组脱矿液和人工唾液中胶原降解量的结果见表2。由表2可以看出，各组牙本质粉经过7天的pH循环后均有胶原降解发生。结果显示空白组的脱矿液上清中的胶原降解量高于醋酸氯己定组和CMT-3组，差异有统计学意义(P <0.05);空白组的人工唾液上清中的胶原降解量也高于醋酸氯己定组和CMT-3组，差异有统计学意义(P <0.05)。醋酸氯己定组和CMT-3组在脱矿液上清和人工唾液上清中的胶原降解量进行比较，差异无统计学意义(P >0.05)。 结果表明pH改变可以导致牙本质胶原的降解，而MMPs抑制剂可以抑制胶原的降解。

讨 论

近30年前，Dayan首次报道龋坏牙本质中的胶原降解可能与内源性胶原酶的活化有关[8]。这之后，又有学者在脱矿的牙本质龋损中检测出有活性的MMPs存在[9]。以后的研究表明，恒牙牙本质中存在MMPs[2,3]，且MMPs可能参与降解牙本质胶原[4]。而目前乳牙牙本质中MMPs存在的情况及与牙本质胶原降解关系的研究尚少。乳牙易患龋，龋病进展迅速，可能与乳牙的釉质薄、牙本质有机质相对含量比恒牙高有关。我们用pH循环模拟菌斑下pH的　　　　　　变化，排除细菌因素的干扰,以此观察乳牙牙本质胶原的降解情况。

实验中对胶原降解量的检测采用的是羟脯氨酸的酶联免疫方法。因牙本质中的有机质主要是I型胶原，即有机质的降解主要表现为胶原的降解。羟脯氨酸是胶原分子中特有的氨基酸，在人胶原蛋白中所占的比例是恒定的，所以测定标本中羟脯氨酸的含量，可反应胶原降解的情况[7]。我们在pH循环的脱矿液和人工唾液中均加入了蛋白酶抑制剂protease inhibitor cocktail，其可抑制其它内源性蛋白酶如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶和氨肽酶的活性，但却对MMPs没有抑制作用，故实验结果中检测到的胶原降解可单纯解释为MMPs的作用。此外，实验以牙本质粉代替牙本质块，不仅可去除乳牙的个体差异，还可对胶原降解进行定量分析，使结果更具可比性。

实验中使用2种MMPs抑制剂，因2种抑制剂抑制MMPs的机制略有不同。醋酸氯己定主要通过螯合金属离子抑制MMPs的活性，而CMT-3是化学修饰的四环素，通过与钙离子的螯合作用，有效的抑制MMPs的活性[10]。醋酸氯己定作为常用的MMPs抑制剂，它抑制MMPs活性的作用已广为接受。Hebling等[11]对儿童口内乳牙进行粘接效果观察，发现醋酸氯己定处理过的乳牙牙本质，在酸蚀粘接后的半年里保持正常、完整的胶原网状结果，而未用醋酸氯己定处理的乳牙牙本质网状胶原纤维结构破坏。Carrilho等[12]通过对脱矿后的牙本质进行人工唾液孵育4周发现，醋酸氯己定可减少胶原破坏，维持牙本质的弹性模量，而未用醋酸氯己定处理的牙本质胶原破坏多，弹性模量明显降低。目前CMT-3的应用还较少，它虽为四环素类药物，但没有抗菌性，对 致龋菌没有作用，这为研究MMPs与龋病关系的动物实验提供了有效前提。本实验拟寻找更为有效的MMPs抑制剂，结果中CMT-3组与醋酸氯己定组的胶原降解量并没有显著性差异，提示0.02%CMT-3与0.2%醋酸氯己定抑制MMPs活性的效果无明显差别。但在 临床应用中，无色的CMT-3可能会比易造成着色的醋酸氯己定更具优势。

MMPs通常以无活性的酶原形式分泌，需要激活才能发挥降解有机质的作用。Tjaderhane等[9]研究发现MMPs在pH4.5的环境下可以活化，他认为是pH值的变化使MMPs酶原的二级和三级结构及多肽的构象发生改变，从而打开 “半胱氨酸开关”使MMPs活化。我们采用体外pH循环的方法，通过pH的变化使牙本质中的MMPs活化。实验以6h酸性脱矿时间及18h人工唾液缓冲时间来模拟体内菌斑下牙齿的微环境，接近 环境中一天的pH生理变化时间。经过7d的pH循环显示，脱矿液和人工唾液中均可检测到胶原降解的发生，证明牙本质中的MMPs可被pH改变所激活，从而发挥降解牙本质有机质的作用。pH的改变不仅使MMPs活化，而且可造成牙本质脱矿，牙本质胶原暴露，活化后的MMPs可进一步降解暴露的牙本质胶原。

本研究通过检测胶原降解量的方法证明，乳牙牙本质中的MMPs可在酸脱矿的过程中活化，从而造成牙本质胶原的降解和有机质的破坏;MMPs抑制剂可抑制牙本质胶原的降解，推测使用MMPs抑制剂有可能对乳牙龋病的迅速发展起到一定的抑制作用[13]，为临床应用MMPs抑制剂抑制牙本质龋进展提供理论依据。

参考文献

1 Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res, 2003, 92(8): 827-839.

2 Mazzoni A, Pashley DH, Tay FR, et al. Immunohistochemical identification of MMP-2 and MMP-9 in human dentin: correlative FEI-SEM/TEM analysis. J Biomed Mater Res A, 2009, 88(3): 697-703.

3 Sulkala M, Tervahartiala T, Sorsa T, et al. Matrix metalloproteinase-8(MMP-8) is the major collagenase in human dentin. Arch Oral Biol, 2007, 52(2): 121-127.

4 Vidal CM,Tjaderhane L,Scaffa PM, et al. Abundance of MMPs and cysteine cathepsins in caries-affected dentine. J Dent Res, 2014, 93(3): 269-274.

5 徐珺,葛丽华,宿颖. 基质金属蛋白酶2、8、9在乳牙牙本质中的表达及含量分析. 北京 医学，2011，19(2)：67-69.

6 Argenta RM, Tabchoury CP, Cury JA. A modifiedpH-cyclingmodel to evaluate fluoride effect on enameldemineralization. Pesqui Odontol Bras, 2003, 17(3): 241-246.

7 Klont B, Damen JJ, ten Cate JM. Degradation of bovine incisor root collagen in an in vitro caries model. Arch Oral Biol, 1991, 36(4): 299-304.

8 Dayan D, Binderman I, Mechanic GL. A preliminary study of activation of collagenase in carious human dentine matrix. Arch Oral Biol, 1983, 28(2): 185-187.

9 Tjaderhane L, Larjava H, Sorsa T, et al. The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentine matrix breakdown in caries lesions. J Dent Res, 1998, 77(8): 1622-1629.

10 Acharya MR, Venitz J, Figg WD, et al. Chemically modified tetracyclines as inhibitors of matrix metalloproteinases. Drug Resist Updat, 2004, 7(3): 195-208.

11 Hebling J, Pashley DH, Tjaderhane L, et al. Chlorhexidine arrests subclinical degradation of dentin hybrid layers in vivo. J Dent Res, 2005, 84(8): 741-746.

12 Carrilho MR, Tay FR, Donnelly AM, et al. Host-derived loss of dentin matrix stiffness associated with solubilization of collagen. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2009, 90(1): 373-380.

13 Chaussain C,Boukpessi T,Khaddam M,et al. Dentin matrix degradation by host matrix metalloproteinases: inhibition and clinical perspectives toward regeneration. Front Physiol, 2013, 4: 308.