报告摘要　　Cellular and molecular mechanisms of hypoxia-induced pulmonary hypertension

　　Yiu-Fai Chen，Ph.D.

　　Professor of Medicine，Vascular Biology and Hypertension Program，Division of Cardiovasular Disease，Department of Medicine，University of Alabama at Birmingham，Birmingham，AL，USA

　　Atrial natriuretic peptide (ANP) and transforming growth factor (TGF)-β play counterregulatory roles in the development of hypoxia-induced pulmonary hypertension and vascular remodeling. We have demonstrated that ANP-cyclic GMP (cGMP)-protein kinase G (PKG) signaling inhibits TGF-β signaling by blocking TGF-β-induced nuclear translocation of Smad3 in pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC).  We tested the hypothesis that activation of the ANP-cGMP-PKG pathway limits TGF-β-induced Smad3 nuclear translocation by enhancing Smad3 binding to cytosolic anchoring proteins in isolated PASMCs.  PASMCs were pretreated with cGMP or vehicle and then exposed to TGF-β1 treatment. Cytosolic fractions were isolated and immunoprecipitated with a selective anti-Smad3 antibody.  Differential proteomic analysis of the cytosolic Smad3-interacting proteins by 2-D differential in-gel electrophoresis and mass spectroscopy followed by co-immunoprecipitation and immunostaining demonstrated that Smad3 was bound to β2-tubulin in a TGF-β1/cGMP-dependent manner.  Binding of Smad3 to β2-tubulin was decreased by TGF-β1 and increased by cGMP treatment. A site-directed mutagenesis study demonstrated that mutating Smad3 at Thr388，but not Ser309，two potential sites of PKG-induced hyperphosphorylation，inhibited cGMP-induced Smad3 binding to β2-tubulin. Further，luciferase reporter analysis showed that mutation of T388 in Smad3 abolished the inhibitory effect of cGMP on TGF-β1-induced plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) transcription.  In addition，disruption of β2-tubulin with the microtubule depolymerizers nocodazole and colchicine promoted Smad3 dissociation from β2-tubulin，increased both TGF-β1-induced Smad3 nuclear translocation and PAI-1 mRNA expression，and abolished the inhibitory effects of cGMP on these processes.  In contrast，the microtubule stabilizers paclitaxel and epothilone B increased cytosolic Smad3 binding to β2-tubulin and enhanced the inhibitory effect of cGMP on Smad3 nuclear translocation and PAI-1 expression in response to TGF-β1.  These provocative findings suggest that sequestering Smad3 by β2-tubulin in cytosol is a key mechanism by which ANP-cGMP-PKG signaling interferes with downstream signaling from TGF-β and thus protects against pulmonary arterial remodeling in response to hypoxia stress.

　　Chronic hypoxia activates TGF-β signaling and leads to pulmonary vascular remodeling. Pharmacological activation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ) has been shown to prevent hypoxia-induced pulmonary hypertension and vascular remodeling in rodent models，suggesting a vasoprotective effect of PPAR-γ under chronic hypoxic stress.   We tested the hypothesis that there is a functional interaction between TGF-β/Smad signaling pathway and PPAR-γ in isolated PASMCs under hypoxic stress.  We observed that chronic hypoxia led to a dramatic decrease of PPAR-γ protein expression in whole lung homogenates and hypertrophied pulmonary arteries and isolated PASMCs. Using a transgenic model of mouse with inducible overexpression of a dominant-negative mutant of TGF-β receptor type II，we demonstrated that disruption of TGF-β pathway significantly attenuated chronic hypoxia-induced downregulation of PPAR-γ in lung.  Similarly，in isolated rat PASMCs，antagonism of TGF-β signaling with either a neutralizing antibody to TGF-β or the selective TGF-β receptor type I inhibitor SB431542 effectively attenuated hypoxia-induced PPAR-γ downregulation. Further，we demonstrated that TGF-β1 treatment suppressed PPAR-γ expression in PASMCs under normoxia condition.  Chromatin immunoprecipitation analysis showed that TGF-β1 treatment significantly increased binding of Smad2/3，Smad4，and the transcriptional corepressor histone deacetylase 1 to the PPAR-γ promoter in PASMCs.  Conversely，treatment with the PPAR-γ agonist rosiglitazone attenuated TGF-β1-induced extracellular matrix molecule expression and growth factor in PASMCs.  These data provide strong evidence that activation of TGF-β/Smad signaling，via transcriptional suppression of PPAR-γ expression，mediates chronic hypoxia-induced downregulation of PPAR-γ expression in lung.

　　更多报告阅读

　　Novel strategy of cell-based therapy for vascular and cardiac diseases

　　Yiu-Fai Chen，Ph.D.

　　Professor of Medicine，Vascular Biology and Hypertension Program，Division of Cardiovasular Diseases，Department of Medicine，University of Alabama at Birmingham，Birmingham，AL，USA

　　The endothelium is a dynamic component of the cardiovascular (CV) system that plays an important role in health and disease. It is not only a barrier between the circulating blood and vascular smooth muscle cells (VSMCs)，but also the source of a variety of mediators that regulate vascular tone and growth，platelet function/ coagulation，and angiogenesis/vascularization.Endothelial damage/dysfunction leads to loss of its anti-aggregative，anti-thrombotic，anti-inflammatory and anti-VSMC activation/growth properties.

　　Neutrophils form the early line of defense against tissue injury. Neutrophils migrate in response to the chemoattractant interleukin-8 (IL-8) (CINC2β in rat) that is expressed and released in large amounts by injured or infected tissues  IL-8 binds to selective receptors (IL8RA and IL8RB) on the neutrophil surface，and activated IL8RA and/or IL8RB induce expression of chemotactic and cytotoxic mediators that trigger local inflammation. Neutrophils are the main leukocyte subset that interacts with injured tissue，triggers the initial pro-inflammatory response，and facilitates the influx of other classes of inflammatory cells e.g.  monocytes/macrophages and T cells in the setting of acute vascular injury and ischemic injury of the myocardium.  Inhibition of neutrophil infiltration decreases the inflammatory responses of injured tissues.

　　Cell-based therapies for cardiovascular diseases (CVD) have proliferated over the past decade，but with limited success.  The major hurdles for successful cell therapies are 1) cell type selection (e.g. progenitor vs. differentiated)，2) time for cell delivery (e.g. acute vs. chronic)，3) cell delivery mode (e.g. peripheral vs. directly into tissue)，4) rejection of transplanted cells (e.g. autologous vs. heterologous)，and most importantly，5) targeting delivery of cells to damaged organs to maximize therapeutic effects. 

　　We have developed an innovative strategy to overcome these hurdles by intravenously transfusing endothelial cells (ECs) overexpressing IL8RA and IL8RB into rats with experimental endoluminal injury of the carotid artery (by balloon).  We tested whether administration of IL8RA- and/or IL8RB-transduced rat aortic ECs accelerates adhesion of ECs to the injured surface，thus suppressing inflammation and neointima formation in balloon injured rat carotid arteries.  We tested the hypothesis that targeted delivery of ECs by overexpressing IL8RA and RB receptors prevents inflammatory responses and promotes structural recovery of arteries following endoluminal injury. 

　　Young adult male rats received balloon injury of the right carotid artery and were transfused i.v. with ECs (total 1.5x106 cells at 1，3，and 5 hrs post injury) transduced with adenoviral vectors carry IL8RA，IL8RB，IL8RA/RB (dual transduction) genes，AdNull (empty vector)，or vehicle (no EC transfusion).  ECs overexpressing IL8Rs inhibited pro-inflammatory mediators expression significantly (by 60-85%) and reduced infiltration of neutrophils and monocytes/macrophages into injured arteries at 1 day post injury，as well as stimulating a 2-fold increase in re-endothelialization at 14 days post injury.  IL8RA-EC，IL8RB-EC，and IL8RA/RB-EC treatment reduced neointima formation dramatically (by 80%，74%，and 95%) at 28 days post injury.

　　In summary，we have demonstrated that acute transplantation of ECs equipped with the homing device (IL8RA and IL8RB) inhibits inflammation and adverse remodeling of injured vascular tissues.  ECs with overexpression of IL8RA and/or IL8RB mimic the behavior of neutrophils that target and adhere to injured tissues，preventing inflammation and neointima formation.  Targeted delivery of ECs to arteries with endoluminal injury provides a novel strategy for the prevention and treatment of cardiovascular disease.  This study fundamentally advances the field of cell-based therapy by providing a noninvasive and cost effective treatment modality.