ROS1分子亚型肺癌的研究进展

常建华

肺癌是目前恶性肿瘤死亡的首要原因，其中NSCLC 约占肺癌病例的80%。随着分子靶向药物研究的不断深入，以表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂为代表的分子靶向药物揭开了NSCLC 治疗的新篇章。而随着越来越多的肺癌相关驱动基因被发现，如ROS1、RET、K-Ras、HER2、BRAF、PI3KCA、MEK1/2、MET 等，其相应的抑制剂亦在临床治疗研究中取得一定进展。C-ROS原癌基因1酪氨酸激酶(ROSl)是受体型酪氨酸激酶，最初发现于恶性胶质瘤中，其编码基因的重排已成为NSCLC 发生和发展的驱动基因。本文重点介绍ROS1基因重排在NSCLC发病中的作用，以及针对该靶点抑制剂的研究进展，以期为NSCLC研究和治疗提供新的思路。

ROS1 融合基因的结构及功能

ROS1 基因最初是在鸟肉瘤病毒(UR2)发现的具有独特致癌作用的基因序列。而人类ROS1基因定位于6q21染色体，属于酪氨酸激酶胰岛素受体基因，由胞内酪氨酸激酶活性区、跨膜区及胞外区3 部分组成，编码具有酪氨酸激酶活性的嵌合蛋白。ROS1基因发生重排时丢失细胞外区域，保留跨膜区和胞内酪氨酸激酶区域，重排位点主要发生在ROS1 基因的32~36 外显子。在NSCLC中ROS1 基因主要与SLC34A2、CD74 发生融合，并持续激活ROS1 酪氨酸激酶区及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路，进而引起肿瘤的发生。

ROS1 融合基因检测方式

目前用于检测肺癌融合基因的常用方法主要是实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR)、荧光原位杂交(FISH)和免疫组织化学(IHC)。但针对ROS1 融合基因检测方式尚未统一。RT-PCR可明确融合型且所需组织量极少，但对组织中RNA的质量要求高，不能检测新的未知的融合型。而FISH特异性较高，并能检测未知融合型，但其检测费用较高、检测结果判读较难。IHC具有简便、快速、检测成本较低等优点，但其检测的准确性依赖于ROS1融合蛋白的表达量及相应抗体的特异性、敏感性。总之，以上3种常用的检测方法均各有利弊，可根据实际情况及研究需要选择合适的检测方法。另外，随着分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，基因检测手段有了革命性的变化。从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到新一代测序(NGS)的相继出现，基因检测技术得到了迅猛发展。NGS 技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，对于发现ROS1新融合亚型或已知基因新突变也具有重要意义。

ROS1 融合基因阳性NSCLC 患者的临床、病理及生物特征

NSCLC中与ROS1重排的伙伴基因众多，目前，在NSCLC患者及细胞株中已发现13个不同的ROS1 融合基因型，包括CD74、SLC34A2、GOPC、CCDC6、SDC4、TPM3、EZR、LRIG3、KDEL R2、LIMA1、MSN、CLTC 和TMEM106B。ROSl重排在NSCLC中的发生率约为1%~2%，但在EGFR/K-Ras/ALK 均阴性的人群中的发生率则可提高到5.7%。一般认为ROS1 融合基因阳性的肺癌患者，不伴有EGFR突变和(或)ALK-EML4 融合基因及K-Ras 突变，但随着研究的深入以及实验技术的发展，目前有少量研究发现，ROS1融合基因与其他基因共存。如rimkunas等在9例ROS1融合基因阳性的患者中，发现两例患者伴随EGFR(L858R)或EGFR(E746-A750del)突变。

作为肺癌驱动基因的新靶点，明确ROS1融合基因阳性人群临床特征对指导临床实践有重要意义。ROS1 基因重排阳性与ALK 重排阳性的NSCLC 患者具有相似性的临床特征，即为年轻、从不吸烟的肺腺癌患者。Bergethon 等对18例ROS1 融合基因阳性患者的年龄、性别、吸烟状态等临床特征进行分析，结果发现ROS1重排更多地发生于亚裔、不吸烟、女性、腺癌患者。Takeuchi 等对13 例ROS1 重排阳性患者的临床特征进行分析，结果表明ROS1融合在年轻不吸烟患者中所占比例较高，这与Bergethon 等人的研究结果相似。在预后方面，Bergethon 等人治疗的浸润性NSCLC 患者总生存(OS)期在ROS1重排阳性(663天)和阴性患者(607天)之间未见差别。但Lee 等报ROS1 过表达与Ⅰ期NSCLC患者较差总生存正相关。Cai等报告，在中国人群中，ROS1融合基因阴性患者比阳性患者有更长的生存期(P =0.041)。这种差异可能与各研究的人群分期不同及样本量有关。

针对ROS1 融合基因抑制剂--克唑替尼的应用

最近的氨基酸序列分析表明，ROS1基因和ALK 基因在酪氨酸激酶区域的同源性可达49%，而在激酶催化区的ATP结合位点，二者同源性高达77%，这可能是ALK 抑制剂克唑替尼(crizotinib)在治疗ROS1基因融合变异的NSCLC中取得明显疗效的共同基础。

2010年，Kwak等最先成功报告ALK激酶抑制剂克唑替尼治疗ROS1 重排变异单病例NSCLC患者。患者为31岁、不吸烟的男性多灶性细支气管肺泡癌患者，未见EGFR突变和ALK重排。既往接受一线厄洛替尼治疗，病情呈现进展，并出现呼吸困难等症状。经额外基因检测为ROS1重排阳性，即给予克唑替尼标准治疗(250 mg，bid，po)。不到1 周，患者临床症状明显改善，两周后缺氧消失，12周时，复查胸部CT提示病灶全部消失，达到完全缓解(CR)。继续随访6个月无复发迹象。2013年美国临床肿瘤学会年会(ASCO 2013)上报告的大样本量ROS1融合基因阳性的Ⅰ期临床试验数据表明，31 例ROS1 阳性晚期NSCLC 患者治疗总缓解率为56%，6个月无进展生存率达到71%，证实克唑替尼在ROS1 融合基因阳性NSCLC 患者中具有良好抗肿瘤活性。

而2014 年9 月，来自美国麻省总医院癌症中心的Shaw 教授等公布了一项克唑替尼用于ROS1 阳性的进展期的Ⅰ 期临床试验(NCT00585195)结果，该研究共招募了50 例ROS1基因重排的晚期NSCLC患者，其中84%的受试者之前已接受过治疗。受试者每日两次以标准剂量250 mg 口服克唑替尼，结果显示，克唑替尼对该组患者治疗高度有效。总体客观缓解率为72%(95%置信区间58%~84%)，其中3例完全缓解，33 例部分缓解，而这些患者此前接受细胞毒化疗的总缓解率尚不足10%。克唑替尼的缓解率较持久，中位缓解时间为17.6 个月，中位无进展时间为19.2 个月，其中有25 例患者尚无进展。克唑替尼的安全性与ALK 基因重排的NSCLC 是相似的。观察到的最常见副作用为视觉障碍(82%)，腹泻(44%)，恶心(40%)和外周性水肿(40%)。这些不良反应大多为1 或2 级。据此临床试验，最近美国食品与药物管理局(FDA)已授予克唑替尼突破性药物资格，用于ROS1 阳性NSCLC 的潜在治疗。ROS1 重排为克唑替尼提供了第二个有效治疗的患者亚群。

克唑替尼耐药后的治疗——第二代ALK激酶抑制剂的探索

同许多靶向药物一样，ROS1 阳性患者经过开始阶段的克唑替尼治疗敏感期后不可避免地出现获得性耐药。在Shaw 等进行的研究中，在数据截止时间，50 例患者中有23 例已(46%)出现疾病进展或者死亡。既往报告也研究了克唑替尼治疗ROS1 阳性NSCLC的耐药机制，大概可以分为两类：使靶基因改变的突变或扩增基因的出现，如ROS1 激酶区域出现的G2032R;替代信号通路的激活使肿瘤细胞对ALK-信号通路失去依赖性，如EGFR 信号通路等旁路激活。

目前，第二代ALK 酪氨酸激酶抑制剂正在研制和试验当中，2014 年，第二代ALK 激酶抑制剂ceritinib 获美国FDA 批准，用于经克唑替尼治疗后病情恶化或对克唑替尼不耐受的ALK+转移性NSCLC 患者的治疗。最近研究显示，部分第二代ALK 抑制剂，如PF-06463922，AP26113，ASP3026 等具有抗ROS1 活性。例如，PF-06463922 是一个强效、次纳摩尔级别的双重ALK/ ROS1 抑制剂，Zou 等在体内外试验均证实了其抗ROS1 融合基因的作用。在体外试验里，PF-06463922 能有效抑制克唑替尼耐药的ROS1 G2032R 突变及ROS1 G2026M 门控基因突变。相比于克唑替尼和第二代ALK/ROS1 抑制剂certinib 和alectinib，PF-06463922显示了更强效的抗ROS1 激酶的活性。在体内试验中， PF-06463922 在FIG-ROS1，CD74-ROS1，CD74-ROS1 G2032R 突变的荷瘤小鼠模型中具有显著的抗肿瘤活性。除此之外，PF-06463922 能有效的穿透血脑屏障，这将有助于对肺癌脑转移患者的治疗。目前一项关于PF-06463922 治疗ALK/ROS1 突变的晚期NSCLC 患者的Ⅰ/Ⅱ 期临床试验(NCT01970865)正在进行中。后续需要进一步研究以确定其对克唑替尼治疗后进展的ROS1阳性肿瘤是否有效。

结语

以分子分型为基础的肿瘤靶向治疗代表了肿瘤治疗的最新发展方向。ROSl融合基因的发现及其抑制剂临床活性的证实，对于指导临床用药、治疗方案选择，筛选靶向药物受益人群都极有益处。但目前ROS1 融合蛋白下游信号通路、ROS1 抑制剂耐药机制尚未完全阐明，只有更加深入地了解该亚型NSCLC的发生、发展机制，才能研发新的特异性ROS1酪氨酸激酶抑制剂，发展并完善肺癌的个体化治疗。