微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)作为一类小的非编码RNAs，在调控mRNA的翻译和降解中发挥重要的作用。 MiRNAs主要位于染色体的脆性位点，包括杂合性缺失区域以及常见的断点区域，提示其可能参与了肿瘤的发生。

一、 MicroRNAs与NSCLC发生

(一)肺腺癌干细胞的分离及其miRNAs表达谱

1. 小鼠肺干细胞的分离及其miRNAs表达谱 小鼠肺终末细支气管肺泡连接区有一群共表达Clara细胞特异性抗原(clara cell specific antigen, CCA)和肺泡表面活性蛋白C(surfactant protein C, SP-C)的细胞，被称为支气管肺泡干细胞(bronchoalveolar stem cell, BASC)，其表面标记是CD45-CD31-Sca-1+CD34+。我们用酶消化法制备小鼠肺单细胞悬液，免疫磁珠分选Sca-1+细胞，无血清细胞培养基培养，流式细胞仪分选CD45-CD31-Sca-1+CD34+细胞(即BASCs)，CCA和SP-C双重免疫荧光染色鉴定BASCs。从BASCs和CD45-CD31-Sca-1-对照细胞中分别提取小RNA，微阵列法检测miRNA的表达并比较差异，共发现116个显著差异表达的miRNA，其中56个miRNA在BASCs高表达，60个miRNA在BASCs低表达。选取了与细胞周期、干细胞分化和肿瘤发生相关的10个重要miRNA，经qRT-PCR检测验证，发现在BASCs中miR-497高表达，而miR-142-3p，miR-451，miR-106a，miR-142-5p，miR-15b，miR-20a，miR-106b，miR-25和miR-486均低表达。作用靶点预测表明，Wee1是miR-497调控靶基因。后续研究表明， NSCLC患者Wee1表达缺失并与患者预后不良及高复发率相关;上调Wee1蛋白表达可显著抑制A549细胞和H157细胞增殖。

2.肺腺癌细胞株干细胞的分离及其miRNAs表达谱 用紫杉醇联合无血清培养可富集比例大于86%的CD133+/CD326+细胞，与上述CCA+/ SP-C+一样，CD133+/CD326+细胞可在人肺腺癌组织中发现，且具有干细胞特性。对CD133+/CD326+细胞和CD133-/CD326-细胞进行芯片筛选，发现50个异常表达的miRNA分子，其中14个上调，36个下调;对其中10个分子行qRT-PCR检测验证，发现6个分子表达趋势与芯片一致(miR-183、miR-127-3p上调，miR-17、miR-155、miR-29a和miR-29b下调);人肺腺癌原代组织筛选后，发现miR-183、miR-127-3p(均上调)及miR-17(下调)的表达与细胞株芯片及定量PCR结果一致，其潜在靶基因与细胞周期、转化、侵袭及信号转导的调控密切相关，广泛参与了肿瘤的发生发展进程。

二、 MicroRNAs与NSCLC浸润、转移

CXC类趋化因子受体4(CXCR4)可作为高侵袭性癌干细胞的标志之一。我们以Sca-1+ CXCR4+为标志物，从小鼠Lewis lung carcinoma(LLC)细胞系中成功分离出干细胞样细胞，与Sca-1-CXCR4-对比，qRT-PCR检测表明，miR-223呈8.26倍下降;生物信息学预测其可能与肺腺癌细胞IGF1R信号通路调控有关;过表达miR-223后，IGF1R及其下游的信号分子Akt和Erk也下调，效应分子VEGF、MMP9分泌减少，LLC细胞侵袭、迁移能力显著受抑。结果表明，LLC细胞干细胞样细胞miR-223的显著低表达与其高侵袭性相关。

三、 MicroRNAs与NSCLC实验治疗

研究表明，miR-let-7在肺癌组织中低表达，其在转录后水平能抑制RAS等癌基因的表达。为了检测let-7a是否具有治疗效果，我们首先建立lewis肺癌模型，当肿瘤体积约为100～200 mm3时进行let-7a慢病毒质粒(Lenti-let-7a)瘤内注射治疗。结果显示Lenti-let-7a或紫杉醇单独治疗，肿瘤生长均出现明显抑制，在28 d抑瘤率分别为49.6%和70.1%。Lenti-let-7a联合紫杉醇治疗的抑瘤率为92.9%，其中一只小鼠在治疗后12d肿瘤消失。瘤内注射18d后， Lenti-let-7联合紫杉醇治疗，瘤重为(0.16 ± 0.19)g，较生理盐水组及单用let-7a组显著降低(P <0.01);形成的肺结节数为(5.33±0.58)个，较生理盐水组显著降低(P <0.01)。免疫组化检测可见，let-7a组仅部分细胞浆有少量黄色颗粒，呈弱阳性，说明let-7a可以通过抑制K-Ras蛋白的表达而抑制肿瘤的生长。

四、 MicroRNAs与NSCLC临床病情监测

1. NSCLC血浆miR-125a-3p、IGF-2的表达及其临床意义 收集健康献血者血浆20例， NSCLC患者治疗前血浆144例，其中73例为临床各期的初诊患者，71例为配对的晚期肺腺癌组织标本及血浆标本(包括初治和曾经接受过治疗的患者)。ELISA检测血浆IGF-2表达，qRT-PCR检测血浆miR-125a-3p的表达，焦磷酸测序法检测71例肺腺癌组织EGFR突变状态。发现miR-125a-3p的表达量与NSCLC分期相关，III/IV期患者较I/II期患者显著低表达(p=0.001)，且有淋巴结转移组较无转移组低表达;同时NSCLC患者血浆IGF-2表达较健康组显著升高，有淋巴结转移组较无转移组高表达。血浆miR-125a-3p与IGF-2表达量呈显著负相关(r=-0.280，p=0.007)。还发现30例EGFR突变型患者血浆中IGF-2的表达量972.557(827.283～1079.692)较41例野生型患者1055.151(951.141～1172.8469)显著降低(P=0.043)，认为血浆中miR-125a-3p低表达、靶基因IGF-2高表达与NSCLC的侵袭转移相关，可望作为监测NSCLC的侵袭转移潜在标志物;血浆中IGF-2的低表达可能作为预测肺腺癌EGFR突变状态的潜在指标。

2. miR-182与NSCLC的临床病理特征及作用机制 qRT-PCR检测NSCLC细胞系以及30组配对的NSCLC癌组织和癌旁正常肺组织样本中的miR-182的表达;在NSCLC细胞株A549和H1299中过表达miR-182后，测定细胞侵袭、迁移能力;构建荧光素酶报告基因载体(pMIR-RECK)(含有miR-182结合位点的RECK的3'UTR片段)，鉴定miR-182的预测靶基因(RECK);qRT-PCR法和Western blot法分别检测RECK的mRNA和蛋白质的表达。发现MiR-182在NSCLC细胞系和癌组织中的表达显著升高，并与肿瘤的转移相关(P<0.01);过表达miR-182显著下调A549细胞中RECK的mRNA和蛋白质的表达(P <0.05)，促进NSCLC细胞系A549和H1299的侵袭及迁移(P<0.01)。提示MiR-182通过下调RECK信号通路在NSCLC发生和发展中发挥癌基因的作用。

五、 展望

MicroRNAs在肿瘤的发生、发展、诊断、治疗和预后都有重要作用，作为非编码RNA，其结构和功能的研究已成为国家重大科研计划关注的重点;其临床意义也必将随着研究的推进而日益彰显。相信miRNAs的研究将会为深刻认识包括NSCLC在内的恶性肿瘤的发病机制、提高其临床诊治水平、最终改善患者的预后作出重要贡献。