病原体靶向的糖囊泡治疗沙门氏菌病

论文概要

通常不推荐抗生素治疗沙门氏菌病，因为它与长时间的粪便携带相关，而不会减少症状持续时间或严重程度，包封在硫化氢(H2S)反应性糖囊泡中的抗生素可能对沙门氏菌病有潜在的治疗作用。抗生素在沙门氏菌存在时释放，沙门氏菌会产生H2S。该方法可防止抗生素快速吸收到血流中，使其可以在肠道中局部靶向病原体，并减轻小鼠感染模型中的疾病症状。此外，还可以减少肠道微生物群中抗生素诱导的变化，并且由于益生元低聚木糖类似物的释放而增加了潜在有益的乳杆菌丰度。

引言

作为我们与外部环境的连接通道，胃肠道有着巨大的粘膜表面，容易受到肠道病原体的侵袭。由食源性沙门氏菌引起的沙门氏菌病是最多见的肠道疾病之一。全球每年约有1.53亿例胃肠炎、57,000例死亡。

沙门氏菌病的典型症状，包括胃痉挛、恶心和急性腹泻，在食用受污染的食物或水后约6-72小时出现。通常持续4-7天，大多数可自愈。目前的建议是通过口服补液疗法治疗，但不使用抗菌药物治疗。对于病情严重的患者(如严重腹泻、高烧或肠外感染患者)和侵袭性疾病风险增加的人(婴儿、老人及虚弱或免疫抑制的人)，应考虑抗菌治疗。

沙门氏菌病的抗菌治疗与长时间的粪便携带有关，不会减少症状持续时间或严重程度，甚至可能增加病原体长期脱落的发生率8。如果口服给药，抗生素如喹诺酮类和磺胺类药物很容易被全身吸收到血液中，难以在肠道感染部位保留高浓度。吸收不良的口服抗生素，如氨基糖苷类和β-内酰胺类，可以对病原体进行局部肠道靶向。然而，这些抗生素会改变肠道菌群的平衡，导致机会致病菌的过度生长。

为了克服沙门氏菌病患者抗菌治疗的固有缺陷，我们在此引入了一种多功能的基于囊泡的系统，用于递送抗生素以选择性地靶向致病因子沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌。这项研究可能为开发靶向病原体的抗菌微粒提供一条途径，以解决肠道感染，并将不良后果的风险降至最低。

结果

靶向病原体的抗菌糖囊泡的设计

产硫化氢(H2S)是沙门氏菌的典型特征，也是分离沙门氏菌的重要标志物。沙门氏菌通过半胱氨酸脱硫酶的活性从L-半胱氨酸产生H2S或通过硫代硫酸盐还原酶从硫代硫酸盐产生H2S。产生H2S的菌落被认为是最具临床意义和显著性。

通过二硫键桥将木寡糖类似物与1-十二烷硫醇缀合，构建H2S-可裂解的两亲分子(AM)。AM的自发自组装形成平均直径为100nm的球形囊泡，其引起明显的廷德尔效应。计算出AM在水中的临界聚集浓度为0.0225mg / mL。

使用氟喹诺酮抗生素、盐酸环丙沙星(CIP)作为模型药物来研究AM囊泡的药物释放行为，因为氟喹诺酮是沙门氏菌病的一线治疗。从UV / Vis吸收光谱，CIP负载效率为9.2%(w / w)，表明AM囊泡具有良好的药物负载能力。

当在PBS中孵育4小时，模拟胃液(SGF，pH 2)和模拟肠液时，分别从CIP负载的AM囊泡(AM-CIP)释放约2%、4%和6%的CIP( SIF，pH 7)。

由于成人的平均胃排空时间不到4 小时，这一发现表明口服给药时AM-CIP在胃肠环境中相当稳定。相比之下，CIP从AM-CIP快速释放，释放的CIP在4小时后在Na2S(100μM)存在下达到~50%，这与先前观察到的Na2S诱导AM囊泡的解体一致。实际上，Na2S以剂量依赖性方式诱导从AM-CIP释放CIP。

为了观察病原体是否可以分解AM囊泡，产生H2S的病原体鼠伤寒沙门氏菌与AM-CIP共培养。低浓度(<3.28μgmL-1)的AM-CIP具有比相同量的CIP杀菌能力更弱，而它们的活性在高浓度下是相当的。该数据表明鼠伤寒沙门氏菌可以产生足够的H 2 S来分解AM-CIP，这使得释放的CIP能和病原体直接接触。根据比色法，由鼠伤寒沙门氏菌(106CFU mL-1)产生的H2S浓度确定为125μM。

还使用H2S响应荧光探针Fluo，来评估AM囊泡的分解是否依赖于特定细菌。当与鼠伤寒沙门氏菌(产生H2S)一起孵育时，Fluo负载的AM囊泡中的荧光强度远强于甲型副伤寒沙门氏菌(不产生H2S)，观察到AM囊泡只能被分解通过选择性产生H2S的生物如鼠伤寒沙门氏菌。

尽管其他产生H2S的生物如弗氏芽孢杆菌也在与鼠伤寒沙门氏菌相同的细胞密度下诱导出轻微的荧光，但感染肠道中高含量的鼠伤寒沙门氏菌将促进这种致病性的AM囊泡的解体。

靶向病原体的糖囊可有效治疗沙门氏菌病

使用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)建立急性肠道感染小鼠模型。沙门氏菌感染导致体重不断下降。CIP治疗可部分预防体重减轻和增加食物摄入，而AM-CIP比CIP效果更显著，CIP可使胃肠道中沙门氏菌计数减少，但在测试剂量下它不会影响肝脏和脾脏等肠外部位的病原体负荷。相反，AM-CIP可以有效地减少胃肠道中的鼠伤寒沙门氏菌感染，从而减轻其向肝脏和脾脏的传播。

与上述观察结果一致，在未治疗的鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的小肠和肠粘膜下观察到严重的组织破坏和炎性浸润。CIP-AM治疗后，上皮损伤和炎症大大减轻，效果优于CIP。

为了观察肠道的药物释放行为，用Fluo负载的AM囊泡口服给予感染小鼠或正常小鼠。感染小鼠的回肠以时间依赖性方式引发最强的荧光强度，这提示：1)鼠伤寒沙门氏菌触发探针从AM囊泡中释放;2)回肠鼠伤寒沙门氏菌的相对丰度更高。

此外，给予感染小鼠荧光(5-DTAF)标记的鼠伤寒沙门氏菌或装载Fluo的AM囊泡。荧光标记的细菌主要保留在回肠中，即使在口服给药后12小时，观察到回肠是沙门氏菌感染的一个主要部位，因此，在给予Fluo负载的AM囊泡后回肠中具有最强的荧光强度。

总之，这些发现表明AM囊泡在感染部位按需分解。

与吸收不良的口服抗生素不同，可吸收的抗生素如氟喹诺酮类药物不能在肠道感染部位维持治疗浓度。正如预期的那样，CIP容易吸收，并在口服给药后30分钟进入血液。不同的是，在血液中检测到少量CIP，如果用AM-CIP口服给药，大多数CIP在4小时后仍留在肠中。该数据表明AM囊泡可以阻止系统可用的抗生素快速吸收到血流中。

Glycovesicles减少肠道微生物群中抗生素诱导的变化

抗生素治疗肠道感染的一个常见副作用是对肠道微生物群的损害，可能导致机会致病菌的过度生长。现在认为，反复暴露于治疗剂量的抗微生物剂甚至可以导致肠道菌群的长期破坏，并且这种副作用不限于口服抗生素。

为了评估AM-CIP对肠道微生物群落的影响，我们对来自用水、AM、CIP或AM-CIP处理的鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的盲肠粪便中的细菌16S rRNA进行基于焦磷酸测序的分析。

在所有组中观察到类似丰富的类细菌科。最明显不同之处在于CIP处理诱导了Lachnospiraceae科的过度生长。

该家族的一些成员被认为是机会性病原体，已经在发炎的样本中发现，如 伤口、肠易激综合征、龈下裂隙和囊性纤维化。

另一个差异是每种治疗的乳杆菌科的丰度变化。AM-CIP和AM治疗，都大大增加了Lactobacillaceae family的丰度，这可能是由于AM囊泡塌陷后释放的益生元低聚木糖类似物。这是令人鼓舞的，因为来自乳杆菌科的几种菌株显示出对沙门氏菌病原体的高度拮抗作用并且在胃肠道中防止沙门氏菌感染。

由于AM处理组中大量沙门氏菌病原体对乳酸杆菌的抑制作用，AM治疗不会像AM-CIP治疗那样增加乳杆菌科。

为了观察AM-CIP形状的肠道微生物群是否对宿主有益，我们将来自AM-CIP或CIP治疗的沙门氏菌感染的供体小鼠的肠道微生物群转移至受感染的受体小鼠。与接受CIP形状的小鼠相比，接受AM-CIP形肠道微生物群的受体小鼠具有较低的病原体负荷和组织炎症。

为了进一步确定该策略是否可以将抗生素对肠内稳态的损害最小化，一种吸收不良的抗生素——新霉素(NEO)被包封以产生负载新霉素的AM囊泡(AM-NEO)。

尽管给予NEO或AM-NEO，肠内NEO总含量非常相似，正如预期的那样，NEO治疗显著增加了细菌和梭菌的相对丰度，并降低了乳杆菌和弯曲杆菌的含量。相反，AM-NEO治疗没有这些效果。

继而使用无监督的多变量统计方法分析微生物群结构变化，包括基于UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)和非度量多维尺度(NMDS)。NEO治疗展示出微生物群组成的集中聚类，表明NEO减少了微生物群的多样性。相反，AM-NEO治疗不会像NEO那样改变肠道微生物群的构成。

讨论

尽管抗生素是治疗细菌感染的救命工具，但肠道感染患者并不常规推荐抗生素治疗。抗生素会对宿主的微生物群落产生严重损害。这个谜题促使我们制定策略来消除肠道病原体，在抗菌治疗的同时对肠道微生物群产生最小的负面影响。

二硫键已广泛开发用于治疗癌症的还原反应性药物传输系统，因为它可以快速降解并选择性释放肿瘤组织中的物质，其含有比正常组织更高的谷胱甘肽水平。二硫键也可以很容易地被H2S分解，H2S可以通过胃肠道中的几种硫酸盐还原菌(如链球菌、梭杆菌、沙门氏菌、肠杆菌和幽门螺杆菌)选择性地产生。

在该研究中，低聚木糖通过二硫键桥与长链脂肪链缀合以形成两亲分子，其自组装可产生H2S响应性抗生素输送系统。体内毒性评估表明该药物输送系统在小鼠模型中口服给药期间是生物相容和安全的。

通过完善的急性沙门氏菌感染模型，我们发现该系统可以阻止小肠中环丙沙星的快速吸收，并在富含沙门氏菌的感染部位释放抗生素。释放的抗生素由附近的沙门氏菌病原体吸收，从而大大减少细菌负担。在裂解二硫键后，产生的低聚木糖类似物可以促进胃肠道中有益的微生物群Lactobacillaceae的生长。众所周知，低聚糖益生元如低聚木糖只能被有限数量的有益细菌利用，包括乳酸杆菌，并选择性增殖这些有机体。

包括环丙沙星在内的大多数抗生素很容易被吸收并迅速吸收到血液中，这使得它们不利于胃肠道中病原体的局部肠道靶向。该药物递送系统检索上述可吸收抗生素作为药物储库以治疗由产生H2S的病原体引起的肠道感染，这在胃肠道中经历高毒力抗生素抗性感染的情况下可能是极其重要的。

该药物输送系统进一步用于加载一种吸收不良的抗生素，以确定它是否能改善抗生素带来的肠道微生物群损害。令人感兴趣的是，这种输送系统不会大大干扰微生物群，因为单独吸收的抗生素很少。

总之，我们开发了一种H2S反应性抗生素传递系统，用于选择性靶向沙门氏菌。

该系统包括以下特点：(1)防止口服抗生素快速吸收到血液中;(2)允许抗生素局部靶向肠道病原体，从而缓解疾病症状;(3)大大减少抗生素对肠道菌群的损伤;(4)通过可释放的益生元低聚木糖类似物增加有益的微生物群乳杆菌科。

该研究可能为开发靶向病原体的抗微生物糖囊以解决肠道感染开辟了道路。

原文：

Pathogen-targeting glycovesicles as a therapy for salmonellosis.NatureCommunications volume10, Articlenumber:4039(2019)

链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-12066-z