意义

瘤内异质性（ITH）对于确定和跟踪癌症演变成为越来越受关注的主题。然而，ITH对临床预后风险的预测仍不清楚。本文描绘了由ITH驱动的患者分层，我们还提出在非小细胞肺癌（NSCLC）中开发单扇区预测多基因检测（MGT）时，应考虑个体基因的ITH水平。

源自患者的富集循环肿瘤细胞（CTC）的单细胞分子分析，可进一步揭示预测转移风险的生物标志物。通过对转移谱多个步骤的基因进行系统分析，我们证明NSCLC复发早期患者具有精确的特征，可以据此识别高危患者。

摘要

尽管非小细胞肺癌（NSCLC）不仅在肿瘤之间，而且在肿瘤内都具有显著的基因组和转录组异质性，但是验证临床相关基因标记的预测依赖于单个组织样本，包括两种商业上可获得的多基因测试（MGTS）。

本文中，我们报告了瘤内异质性（ITH）对预测NSCLC复发风险具有意料之外的影响，强调需要更好的基因组策略来改善预后。

利用无标记、惯性聚焦微流体方法以单细胞分辨率捕获循环肿瘤细胞（CTC），我们进一步识别了具有不同转移能力的CTC表达谱基因特征。

值得注意的是，调和ITH和CTC衍生基因表达数据的预后风险精确模型，优于预测无复发生存（RFS）的初始分类器。我们提出量身定制的方法来提供可靠的风险评估，同时考虑到NSCLC中ITH驱动的变化幅度。

针对白种人吸烟肺癌患者群体的新兴多区域测序提供了瘤内异质性（ITH）的基因证据。

正文

最近，我们观察到一种复杂的基因组，尽管突变负担低，但在不吸烟的亚洲非小细胞肺癌（NSCLC）中具有不同的拷贝数和早期多样化。

这种ITH在多种分子水平上的临床预后在其他类型癌症中也变得明显，表明ITH驱动的差异可能导致错误的患者分类。然而，目前没有多基因检测（MGT）支持ITH特征选择，包括基于2个基因表达的肺癌患者MGT。

通过将预测多基因分类器应用于多区域数据分析，我们首先描绘了转录组ITH，并检查了ITH对NSCLC患者分层的混淆程度。

该分类器被称为肿瘤基质指数（TMi），已被证实其在2,000多名早期NSCLC患者中具备对预后和辅助化疗反应的预测价值。

TMi是基于29个基质基因表达水平计算的，主要编码非核心基质蛋白，包括细胞外基质（ECM）调节因子（MMP12、MMP1、ADAMTS5）、ECM附属蛋白（GREM1、SFTPC、SFTPA2、SFTPD、FCN3）、分泌因子（S100A2、CXCL13、WIF1、CHRDL1、CXCL2、IL6、HHIP、S100A12）和其他ECM相关成分（LPL、CPB2、MAMDC2、CD36），以及包括胶原蛋白（COL11A1, COL10A1, COL6A6)）和ECM糖蛋白（SPP1、CTHRC1、TNNC1、ABI3BP、PCOLCE2）在内的核心基质分子，与匹配的无肿瘤组织相比，我们发现这些成分在NSCLC中存在更加差异化的表达。

我们发现，尽管TMi是有效的预后预测因子，但是大量的TMi基因显示出显著的ITH并导致同一肿瘤内的不一致分布（同时具备低TMi和高Tmi区域），这表明需要基于ITH水平和患者异质性（IPH）重建基因特征，正如新近对乳腺癌MGT提出的那样。

我们假设，在原发性肿瘤侵袭过程中伴随肿瘤进展的异常matrisomal表达模式也可能是有用的，因此可以在转移的晚期进程中表现出来，如出现在循环血中。

因此，除了多区域原发性肿瘤组织外，我们还评估了循环肿瘤细胞（CTC），以描述预后性TMi特征的肿瘤内表型变异。

最近的单细胞测序研究表明，时空异质性CTC可以监测各种转移性恶性肿瘤的基因组和转录组水平。

虽然单个肿瘤活检可能并不能代表含有空间隔离克隆的整个肿瘤，但CTC的空间和时间变化可能会重现在原发性和转移性癌症的基因表达和途径。

我们进一步采用单细胞而非大量细胞分析来排除可能的白细胞污染，这在转录组学研究中尤为明显，当活化的白细胞同时过度表达癌症相关基因、上皮细胞间质转型和干细胞标记物。鉴于间充质和造血特性，CTC特异性转录物的表达分析复杂化。

我们小组最近开发了一个集成的ClearCell FX和微流体平台工作流程，以：

1）测量来自单个患者的CTC全长mRNA转录组
2）检测在匹配的原发性肿瘤中发现的显性突变。

两项研究中的高质量测序性能指标证明了ClearCell FX富集CTC的遗传完整性，证明了将无标记、标记非依赖性微流体技术纳入下游分子分析和功能研究的可行性。

最近在不同的外部实验室进行的单细胞测序研究进一步证实，通过DEPArray技术分离的富含ClearCell FX的CTC或经过全基因组扩增（WGA）的显微操作器提取的DNA质量高、适合测序、显示出稳健性。

通过对2,748个患者样本进行系统的计算机验证，我们进一步表明，新开发的风险模型仅包含单个CTC衍生的特征，专门针对ITH水平定制，具有强大的预测能力，可用于预测基于组织的样本的无复发生存期（RFS），此类方法可能取代先前确定NSCLC复发高风险早期疾病患者的方法。

结果

ITH驱动的患者错误分类

为了检验ITH对风险预测的影响，我们分析了最近发表的2项研究的手术样本（每个肿瘤3或4个区域）的多区域基因表达谱，使用预后性TMi基因组。我们首先检查了TMi的诊断和预后准确性。在研究1中，TMi在区分正常和肿瘤样本方面取得了极好的诊断准确性，包括来自20个早期NSCLC肿瘤的80个区域和20个匹配的正常肺组织，其中敏感性、特异性ROC曲线下面积均为100％。

为了测试TMi的预后性，我们将研究2的10名NSCLC患者的35个区域根据无复发生存（RFS）分析的理想分界指数分为低TMi和高TMi组。在这个小型患者队列中，预测由模型复发的肿瘤具有显著更差的预后，证明了TMi对RFS预测的稳健预测值。

讨论

CTC的单细胞分析揭示了临床上有用的拷贝数变异和点突变，同时解决了肺癌的异质性程度。然而，这些发现仅与表达上皮标志物的CTC相关，缺失去分化的EpCAM-或间充质/ EMT样CTC，这些都与疾病进展和治疗反应密不可分。

通过依赖无标记方法，我们发现NSCLC肿瘤的转移潜力在于其在基质表达中的异质性特征，其反过来反映在CTC群体中。

根据支持EMT对CTC表型贡献的非排他性假设的结果，原发肿瘤中的TMi高细胞可能在功能上具备其在血流和转移性生态位形成中所需的关键特性，特别是考虑到基质和EMT。

在最近的临床研究中，表达间充质特征的CTC重复性与转移的出现相关，它们在器官特异性转移中的异质性的作用，进一步指向这些侵袭性细胞作为预测转移的主要成分。

论文信息:

Addressing cellular heterogeneity in tumor and circulation for refined prognostication. PNAS September 3, 2019 116 (36) 17957-17962